304 komponent kimik i tubit të mbështjelljes prej çeliku inox, Struktura e ektodominit SPACA6 përmban një superfamilje të ruajtur proteinash të lidhura me shkrirjen e gameteve.

Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Rrëshqitës që tregojnë tre artikuj për rrëshqitje.Përdorni butonat e pasëm dhe të ardhshëm për të lëvizur nëpër rrëshqitje, ose butonat e kontrolluesit të rrëshqitjes në fund për të lëvizur nëpër secilën rrëshqitje.

SPACA6 është një proteinë sipërfaqësore e shprehur nga sperma që është kritike për shkrirjen e gameteve gjatë riprodhimit seksual të gjitarëve.Pavarësisht nga ky rol themelor, funksioni specifik i SPACA6 është kuptuar keq.Ne sqarojmë strukturën kristalore të domenit jashtëqelizor të SPACA6 me një rezolucion prej 2.2 Å, duke zbuluar një proteinë me dy domene të përbërë nga një tufë me katër fije dhe β-sanduiçe të ngjashme me Ig të bashkuara nga lidhës pothuajse fleksibël.Kjo strukturë i ngjan IZUMO1, një proteinë tjetër e lidhur me shkrirjen e gameteve, duke i bërë SPACA6 dhe IZUMO1 anëtarë themelues të superfamiljes së proteinave të lidhura me fekondimin të referuara këtu si superfamilja IST.Mbifamilja IST përcaktohet strukturisht nga tufa e saj e përdredhur me katër spirale dhe një palë motivesh CXXC të lidhura me disulfid.Një kërkim i bazuar në strukturën AlphaFold të proteomës njerëzore identifikoi anëtarë të proteinave shtesë të kësaj superfamiljeje;veçanërisht, shumë nga këto proteina janë të përfshira në shkrirjen e gameteve.Struktura SPACA6 dhe marrëdhënia e saj me anëtarët e tjerë të superfamiljes IST ofrojnë lidhjen që mungon në njohuritë tona për shkrirjen e gameteve të gjitarëve.
Çdo jetë njerëzore fillon me dy gamete të veçanta haploide: spermatozoidin e babait dhe vezën e nënës.Ky spermë është fituesi i një procesi intensiv seleksionimi gjatë të cilit miliona qeliza spermatozoide kalojnë nëpër traktin gjenital të femrës, kapërcejnë pengesa të ndryshme1 dhe i nënshtrohen kapacitetit, i cili rrit lëvizshmërinë e tyre dhe procesin e komponentëve të sipërfaqes2,3,4.Edhe nëse spermatozoidi dhe ovociti gjejnë njëri-tjetrin, procesi nuk ka përfunduar ende.Oociti është i rrethuar nga një shtresë qelizash kumulus dhe një pengesë glikoproteinike e quajtur zona pellucida, përmes së cilës sperma duhet të kalojë për të hyrë në vezë.Spermatozoidet përdorin një kombinim të molekulave të ngjitjes sipërfaqësore dhe enzimave të lidhura me membranën dhe të sekretuara për të kapërcyer këto barriera përfundimtare5.Këto molekula dhe enzima ruhen kryesisht në membranën e brendshme dhe në matricën akrozomale dhe zbulohen kur membrana e jashtme e spermës lizohet gjatë reaksionit akrozomal6.Hapi i fundit në këtë udhëtim intensiv është ngjarja e shkrirjes së spermës-vezës, në të cilën dy qelizat bashkojnë membranat e tyre për t'u bërë një organizëm i vetëm diploid7.Megjithëse ky proces është novator në riprodhimin njerëzor, ndërveprimet e nevojshme molekulare nuk kuptohen mirë.
Përveç fekondimit të gameteve, është studiuar gjerësisht edhe kimia e shkrirjes së dy shtresave të dyfishta lipidike.Në përgjithësi, shkrirja e membranës është një proces energjikisht i pafavorshëm që kërkon që një katalizator proteinik t'i nënshtrohet një ndryshimi të konformitetit strukturor që i afron dy membranat, duke thyer vazhdimësinë e tyre dhe duke shkaktuar shkrirje8,9.Këta katalizatorë proteinikë njihen si fuzogjenë dhe janë gjetur në sisteme të panumërta të shkrirjes.Ato janë të nevojshme për hyrjen e virusit në qelizat pritëse (p.sh., gp160 në HIV-1, kulmi në koronaviruse, hemagglutinina në viruset e influencës) 10,11,12 placentare (sincitinë)13,14,15 dhe bashkimet që formojnë gamete në eukariotët e poshtëm ( HAP2/GCS1 te bimët, protistët dhe artropodët) 16,17,18,19.Fuzogjenët për gametet njerëzore ende nuk janë zbuluar, megjithëse disa proteina janë treguar të jenë kritike për lidhjen dhe shkrirjen e gameteve.CD9 e shprehur në vezë, një proteinë transmembranore e nevojshme për shkrirjen e gameteve të miut dhe njeriut, ishte e para që u zbulua 21,22,23.Megjithëse funksioni i tij i saktë mbetet i paqartë, një rol në ngjitjen, struktura e vatrave ngjitëse në mikrovilet e vezës dhe/ose lokalizimi i saktë i proteinave të sipërfaqes së vezëve duket i mundshëm 24,25,26.Dy proteinat më tipike që janë kritike për shkrirjen e gameteve janë proteina e spermës IZUMO127 dhe proteina e vezëve JUNO28, dhe lidhja e tyre e ndërsjellë është një hap i rëndësishëm në njohjen dhe ngjitjen e gameteve përpara shkrirjes.Minjtë meshkuj me nokaut Izumo1 dhe minjtë me nokaut femra Juno janë plotësisht sterilë, në këto modele sperma hyn në hapësirën periviteline por gametet nuk shkrihen.Në mënyrë të ngjashme, bashkimi u zvogëlua kur gametet u trajtuan me antitrupa anti-IZUMO1 ose JUNO27,29 në eksperimentet e fekondimit in vitro njerëzor.
Kohët e fundit, është zbuluar një grup i sapo zbuluar i proteinave të shprehura në spermë, në mënyrë fenotipike të ngjashme me IZUMO1 dhe JUNO20,30,31,32,33,34,35.Proteina 6 e lidhur me membranën akrozomale të spermës (SPACA6) është identifikuar si thelbësore për fekondim në një studim në shkallë të gjerë të mutagjenezës së minjve.Futja e transgjenit në gjenin Spaca6 prodhon spermatozoa jo të shkrirë, megjithëse këto spermatozoa infiltrojnë hapësirën periviteline 36 .Studimet e mëvonshme nokaut në minj konfirmuan se Spaca6 është i nevojshëm për shkrirjen e gameteve 30,32.SPACA6 shprehet pothuajse ekskluzivisht në testikuj dhe ka një model lokalizimi të ngjashëm me atë të IZUMO1, përkatësisht brenda intimës së spermatozoideve përpara reaksionit akrozomal, dhe më pas migron në rajonin ekuatorial pas reaksionit akrozomal 30,32.Homologët Spaca6 ekzistojnë në një shumëllojshmëri gjitarësh dhe eukariotësh të tjerë 30 dhe rëndësia e tij për shkrirjen e gameteve njerëzore është demonstruar nga frenimi i fekondimit njerëzor in vitro nga rezistenca ndaj SPACA6 30 .Ndryshe nga IZUMO1 dhe JUNO, detajet e strukturës, ndërveprimeve dhe funksionit të SPACA6 mbeten të paqarta.
Për të kuptuar më mirë procesin themelor që qëndron në themel të bashkimit të spermës dhe vezëve të njeriut, i cili do të na mundësojë të informojmë zhvillimet e ardhshme në planifikimin familjar dhe trajtimin e fertilitetit, ne kryem studime strukturore dhe biokimike SPACA6.Struktura kristalore e domenit jashtëqelizor të SPACA6 tregon një pako me katër spirale (4HB) dhe një domen të ngjashëm me imunoglobulinën (si Ig) të lidhur nga rajone thuajse fleksibël.Siç u parashikua në studimet e mëparshme, 7,32,37 struktura e domenit të SPACA6 është e ngjashme me atë të IZUMO1 njerëzore dhe të dy proteinat ndajnë një motiv të pazakontë: 4HB me një sipërfaqe spirale trekëndore dhe një palë motive CXXC të lidhura me disulfidin.Ne propozojmë që IZUMO1 dhe SPACA6 tani të përcaktojnë një superfamilje më të madhe, të lidhur strukturore të proteinave të lidhura me shkrirjen e gameteve.Duke përdorur veçori unike për superfamiljen, ne kryem një kërkim shterues për proteomën strukturore njerëzore AlphaFold, duke identifikuar anëtarë shtesë të kësaj superfamiljeje, duke përfshirë disa anëtarë të përfshirë në shkrirjen dhe/ose fekondimin e gameteve.Tani duket se ekziston një palosje e përbashkët strukturore dhe një superfamilje proteinash që lidhen me shkrirjen e gameteve dhe struktura jonë ofron një hartë molekulare të këtij aspekti të rëndësishëm të mekanizmit të shkrirjes së gameteve njerëzore.
SPACA6 është një proteinë transmembranore me një kalim të vetëm me një glikan të lidhur me N dhe gjashtë lidhje të supozuara disulfide (Figurat S1a dhe S2).Ne shprehëm domenin jashtëqelizor të SPACA6 njerëzore (mbetjet 27-246) në qelizat e Drosophila S2 dhe pastruam proteinën duke përdorur afinitetin e nikelit, shkëmbimin e kationeve dhe kromatografinë e përjashtimit të madhësisë (Fig. S1b).Ektodomina e pastruar SPACA6 është shumë e qëndrueshme dhe homogjene.Analiza duke përdorur kromatografinë e përjashtimit të madhësisë së kombinuar me shpërndarjen poligonale të dritës (SEC-MALS) zbuloi një majë me një peshë molekulare të llogaritur prej 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Kjo është në përputhje me madhësinë e ektodominit monomerik SPACA6, duke treguar se oligomerizimi nuk ka ndodhur gjatë pastrimit.Përveç kësaj, spektroskopia e dikroizmit rrethor (CD) zbuloi një strukturë të përzier α/β me një pikë shkrirjeje prej 51,3 °C (Fig. S1d,e).Dekonvolucioni i spektrave CD zbuloi 38.6% elementë α-spiral dhe 15.8% β-vargëzuar (Figura S1d).
Ektodomina SPACA6 u kristalizua duke përdorur mbjelljen e rastësishme të matricës38 duke rezultuar në një grup të dhënash me një rezolucion prej 2,2 Å (Tabela 1 dhe Figura S3).Duke përdorur një kombinim të zëvendësimit molekular të bazuar në fragmente dhe të dhënave të fazës SAD me ekspozimin e bromit për përcaktimin e strukturës (Tabela 1 dhe Figura S4), modeli përfundimtar i rafinuar përbëhet nga mbetjet 27-246.Në kohën kur struktura u përcaktua, nuk kishte struktura eksperimentale ose AlphaFold të disponueshme.Ektodomina SPACA6 ka përmasa 20 Å × 20 Å × 85 Å, përbëhet nga shtatë spirale dhe nëntë fillesa β, dhe ka një palosje terciare të zgjatur të stabilizuar nga gjashtë lidhje disulfide (Fig. 1a, b).Dendësia e dobët e elektroneve në fund të zinxhirit anësor Asn243 tregon se kjo mbetje është një glikozilim i lidhur me N.Struktura përbëhet nga dy domene: një pako me katër spirale N-terminale (4HB) dhe një domen C-terminal i ngjashëm me Ig me një rajon të ndërmjetëm menteshë ndërmjet tyre (Fig. 1c).
një Struktura e domenit jashtëqelizor të SPACA6.Diagrami i shiritit të domenit jashtëqelizor të SPACA6, ngjyra e zinxhirit nga N në fundin C nga blu e errët në të kuqe të errët.Cisteinet e përfshira në lidhjet disulfide janë të theksuara në magenta.b Topologjia e domenit jashtëqelizor të SPACA6.Përdorni të njëjtën skemë ngjyrash si në figurën 1a.c SPACA6 domeni jashtëqelizor.Grafikët e shiritave të domenit 4HB, mentesha dhe Ig-si janë me ngjyrë portokalli, jeshile dhe blu, përkatësisht.Shtresat nuk janë tërhequr në shkallë.
Domeni 4HB i SPACA6 përfshin katër spirale kryesore (spira 1-4), të cilat janë të rregulluara në formën e një spiraleje spirale (Fig. 2a), të alternuara midis ndërveprimeve antiparalele dhe paralele (Fig. 2b).Një spirale e vogël shtesë me një kthesë (spiralja 1') është vendosur pingul me tufën, duke formuar një trekëndësh me spirale 1 dhe 2. Ky trekëndësh është deformuar pak në paketimin e përdredhur me spirale të paketimit relativisht të dendur të helikave 3 dhe 4 ( Fig. 2a).
Grafik me shirita të terminalit N 4HB.b Pamja e sipërme e një grupi prej katër spiralesh, secila spirale e theksuar me blu të errët në skajin N dhe me të kuqe të errët në skajin C.c Diagrami i rrotave spirale nga lart-poshtë për 4HB, me çdo mbetje të treguar si një rreth të etiketuar me një kod aminoacid me një shkronjë;numërohen vetëm katër aminoacidet në krye të rrotës.Mbetjet jopolare janë me ngjyrë të verdhë, mbetjet e pangarkuara polare janë me ngjyrë jeshile, mbetjet e ngarkuara pozitivisht janë me ngjyrë blu dhe mbetjet e ngarkuara negativisht janë me ngjyrë të kuqe.d Faqet trekëndore të domenit 4HB, me 4HB në ngjyrë portokalli dhe mentesha në të gjelbër.Të dy hyrjet tregojnë lidhje disulfide në formë shufre.
4HB është i përqendruar në një bërthamë të brendshme hidrofobike të përbërë kryesisht nga mbetje alifatike dhe aromatike (Fig. 2c).Bërthama përmban një lidhje disulfide midis Cys41 dhe Cys55 që lidh spirale 1 dhe 2 së bashku në një trekëndësh të ngritur sipër (Fig. 2d).Dy lidhje shtesë disulfide u formuan midis motivit CXXC në Helix 1' dhe një motivi tjetër CXXC të gjetur në majën e β-fishtes në rajonin e menteshës (Fig. 2d).Një mbetje konservative arginine me një funksion të panjohur (Arg37) ndodhet brenda një trekëndëshi të zbrazët të formuar nga spirale 1', 1 dhe 2. Atomet e karbonit alifatik Cβ, Cγ dhe Cδ Arg37 ndërveprojnë me bërthamën hidrofobike dhe grupet e tij guanidine lëvizin në mënyrë ciklike ndërmjet helikave 1' dhe 1 nëpërmjet ndërveprimeve ndërmjet shtyllës kurrizore Thr32 dhe zinxhirit anësor (Fig. S5a,b).Tyr34 shtrihet në zgavër duke lënë dy zgavra të vogla përmes të cilave Arg37 mund të ndërveprojë me tretësin.
Domenet β-sanduiç të ngjashëm me Ig janë një superfamilje e madhe proteinash që ndajnë tiparin e përbashkët të dy ose më shumë fletëve amfipatike me shumë fije floku që ndërveprojnë nëpërmjet një bërthame hidrofobike 39. Domeni C-terminal Ig-si i SPACA6 ka të njëjtin model dhe përbëhet nga dy shtresa (Fig. S6a).Fleta 1 është një fletë β me katër fije (vargjet D, F, H dhe I) ku fillesat F, H dhe I formojnë një rregullim antiparalel dhe fillesat I dhe D marrin një bashkëveprim paralel.Tabela 2 është një fletë beta e vogël antiparalele me dy fije (vargjet E dhe G).Një lidhje e brendshme disulfide u vu re midis C-fundit të zinxhirit E dhe qendrës së zinxhirit H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Kjo lidhje disulfide është analoge me lidhjen disulfide në domenin β-sanduiç të imunoglobulinës40,41.
Fleta β me katër fije rrotullohet përgjatë gjithë gjatësisë së saj, duke formuar skaje asimetrike që ndryshojnë në formë dhe elektrostatikë.Buza më e hollë është një sipërfaqe e sheshtë mjedisore hidrofobike që dallohet në krahasim me sipërfaqet e mbetura të pabarabarta dhe elektrostatikisht të ndryshme në SPACA6 (Fig. S6b,c).Një aureolë e grupeve karbonil/amino të ekspozuar të shtyllës kurrizore dhe zinxhirëve anësor polare rrethon sipërfaqen hidrofobike (Fig. S6c).Diferenca më e gjerë mbulohet nga një segment spirale me kapak që bllokon pjesën N-terminale të bërthamës hidrofobike dhe formon tre lidhje hidrogjenore me grupin polar të hapur të shtyllës kurrizore të zinxhirit F (Fig. S6d).Pjesa C-terminale e këtij skaji formon një xhep të madh me një bërthamë hidrofobike pjesërisht të ekspozuar.Xhepi është i rrethuar nga ngarkesa pozitive për shkak të tre grupeve të mbetjeve të dyfishta të argininës (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 dhe Arg212-Arg214) dhe një histidine qendrore (His220) (Figura S6e).
Rajoni i menteshës është një segment i shkurtër midis domenit spirale dhe domenit të ngjashëm me Ig, i përbërë nga një shtresë β antiparalele me tre fije (vargjet A, B dhe C), një spirale e vogël 310 dhe disa segmente të gjata spirale të rastësishme.(Fig. S7).Një rrjet kontaktesh kovalente dhe elektrostatike në rajonin e menteshës duket se stabilizon orientimin midis 4HB dhe domenit të ngjashëm me Ig.Rrjeti mund të ndahet në tre pjesë.Pjesa e parë përfshin dy motive CXXC (27CXXC30 dhe 139CXXC142) që formojnë një çift lidhjesh disulfide midis flokeve β në varëse dhe spirales 1' në 4HB.Pjesa e dytë përfshin ndërveprimet elektrostatike midis domenit të ngjashëm me Ig dhe menteshës.Glu132 në menteshën formon një urë kripe me Arg233 në domenin e ngjashëm me Ig dhe Arg135 në menteshën.Pjesa e tretë përfshin një lidhje kovalente midis domenit të ngjashëm me Ig dhe rajonit të menteshës.Dy lidhje disulfide (Cys124-Cys147 dhe Cys128-Cys153) lidhin lakun e menteshës me një lidhës që stabilizohet nga ndërveprimet elektrostatike midis Gln131 dhe grupit funksional të shtyllës kurrizore, duke lejuar hyrjen në domenin e parë të ngjashëm me Ig.zinxhir.
Struktura e ektodominit SPACA6 dhe strukturat individuale të domeneve 4HB dhe të ngjashme me Ig u përdorën për të kërkuar të dhëna strukturore të ngjashme në bazat e të dhënave të proteinave 42 .Ne identifikuam ndeshje me rezultate të larta Dali Z, devijime të vogla standarde dhe rezultate të mëdha LALI (kjo e fundit është numri i mbetjeve strukturore ekuivalente).Ndërsa 10 goditjet e para nga kërkimi i plotë i ektodominit (Tabela S1) kishin një rezultat të pranueshëm Z prej >842, vetëm një kërkim për domenin 4HB ose të ngjashëm me Ig tregoi se shumica e këtyre goditjeve korrespondonin vetëm me β-sanduiçe.një palosje e kudogjendur që gjendet në shumë proteina.Të tre kërkimet në Dali dhanë vetëm një rezultat: IZUMO1.
Prej kohësh është sugjeruar që SPACA6 dhe IZUMO1 ndajnë ngjashmëri strukturore7,32,37.Megjithëse ektodominet e këtyre dy proteinave të lidhura me bashkimin e gameteve ndajnë vetëm 21% identitet të sekuencës (Figura S8a), provat komplekse, duke përfshirë një model të konservuar lidhjeje disulfide dhe një domen të parashikuar C-terminal të ngjashëm me Ig në SPACA6, lejuan përpjekjet e hershme për të ndërtuar një modeli homologjik i miut A dhe SPACA6 duke përdorur IZUMO1 si shabllon37.Struktura jonë konfirmon këto parashikime dhe tregon shkallën e vërtetë të ngjashmërisë.Në fakt, strukturat SPACA6 dhe IZUMO137,43,44 ndajnë të njëjtën arkitekturë me dy domene (Fig. S8b) me domene të ngjashme β-sanduiçësh 4HB dhe Ig-si të lidhura nga një rajon menteshë (Fig. S8c).
IZUMO1 dhe SPACA6 4HB kanë dallime të përbashkëta nga tufat konvencionale spirale.4HB tipike, si ato që gjenden në komplekset e proteinave SNARE të përfshira në bashkimin endozomal 45,46, kanë spirale të barabarta duke mbajtur një lakim konstant rreth një boshti qendror 47. Në të kundërt, domenet spirale si në IZUMO1 ashtu edhe në SPACA6 ishin të shtrembëruara, me lakim të ndryshueshëm dhe paketim i pabarabartë (Figura S8d).Përdredhja, ndoshta e shkaktuar nga trekëndëshi i formuar nga spirale 1′, 1 dhe 2, ruhet në IZUMO1 dhe SPACA6 dhe stabilizohet nga i njëjti motiv CXXC në spiralen 1′.Megjithatë, lidhja shtesë disulfide e gjetur në SPACA6 (Cys41 dhe Cys55 që lidhin helikat 1 dhe 2 në mënyrë kovalente) krijon një majë më të mprehtë në majën e trekëndëshit, duke e bërë SPACA6 më të përdredhur se IZUMO1, me trekëndësha më të theksuar të zgavrës.Përveç kësaj, IZUMO1 i mungon Arg37 i vërejtur në qendër të kësaj kaviteti në SPACA6.Në të kundërt, IZUMO1 ka një bërthamë më tipike hidrofobike të mbetjeve alifatike dhe aromatike.
IZUMO1 ka një domen të ngjashëm me Ig të përbërë nga një fletë β me dy fije dhe pesë fije43.Fija shtesë në IZUMO1 zëvendëson spiralen në SPACA6, e cila ndërvepron me vargun F për të kufizuar lidhjet hidrogjenore të shtyllës kurrizore në fillesë.Një pikë interesante krahasimi është ngarkesa e parashikuar sipërfaqësore e domeneve të ngjashme me Ig të dy proteinave.Sipërfaqja IZUMO1 është më e ngarkuar negativisht se sipërfaqja SPACA6.Një tarifë shtesë ndodhet pranë C-terminusit përballë membranës së spermës.Në SPACA6, të njëjtat rajone ishin më neutrale ose të ngarkuara pozitivisht (Fig. S8e).Për shembull, sipërfaqja hidrofobike (skajet më të holla) dhe gropat e ngarkuara pozitivisht (skajet më të gjera) në SPACA6 janë të ngarkuara negativisht në IZUMO1.
Megjithëse lidhja dhe elementët e strukturës dytësore midis IZUMO1 dhe SPACA6 janë ruajtur mirë, shtrirja strukturore e domeneve të ngjashme me Ig tregoi se dy domenet ndryshojnë në orientimin e tyre të përgjithshëm në lidhje me njëri-tjetrin (Fig. S9).Pakoja spirale e IZUMO1 është e lakuar rreth β-sanduiçit, duke krijuar formën e përshkruar më parë "bumerang" në rreth 50 ° nga boshti qendror.Në të kundërt, rrezja spirale në SPACA6 u anua rreth 10 ° në drejtim të kundërt.Ndryshimet në këto orientime ka të ngjarë të jenë për shkak të dallimeve në rajonin e menteshës.Në nivelin e sekuencës parësore, IZUMO1 dhe SPACA6 ndajnë pak ngjashmëri të sekuencës në varëse, me përjashtim të cisteinës, glicinës dhe mbetjeve të acidit aspartik.Si rezultat, lidhjet hidrogjenore dhe rrjetet elektrostatike janë krejtësisht të ndryshme.Elementet e strukturës dytësore të fletës β ndahen nga IZUMO1 dhe SPACA6, megjithëse zinxhirët në IZUMO1 janë shumë më të gjatë dhe spiralen 310 (spiralja 5) është unike për SPACA6.Këto dallime rezultojnë në orientime të ndryshme të domenit për dy proteina ndryshe të ngjashme.
Kërkimi ynë i serverit Dali zbuloi se SPACA6 dhe IZUMO1 janë dy strukturat e vetme të përcaktuara eksperimentalisht të ruajtura në bazën e të dhënave të proteinave që kanë këtë palosje të veçantë 4HB (Tabela S1).Kohët e fundit, DeepMind (Alphabet/Google) ka zhvilluar AlphaFold, një sistem i bazuar në rrjetin nervor që mund të parashikojë me saktësi strukturat 3D të proteinave nga sekuencat primare48.Menjëherë pasi zgjidhëm strukturën SPACA6, baza e të dhënave AlphaFold u lëshua, duke ofruar modele të strukturës parashikuese që mbulojnë 98.5% të të gjitha proteinave në proteomën e njeriut48,49.Duke përdorur strukturën tonë të zgjidhur SPACA6 si një model kërkimi, një kërkim strukturor homologjik për modelin në proteomën njerëzore AlphaFold identifikoi kandidatët me ngjashmëri të mundshme strukturore me SPACA6 dhe IZUMO1.Duke pasur parasysh saktësinë e jashtëzakonshme të AlphaFold në parashikimin e SPACA6 (Fig. S10a) - veçanërisht ektodomina 1.1 Å rms në krahasim me strukturën tonë të zgjidhur (Fig. S10b) - mund të jemi të sigurt se përputhjet e identifikuara SPACA6 ka të ngjarë të jenë të sakta.
Më parë, PSI-BLAST kërkoi për grupin IZUMO1 me tre proteina të tjera të lidhura me spermën: IZUMO2, IZUMO3 dhe IZUMO450.AlphaFold parashikoi që këto proteina të familjes IZUMO palosen në domenin 4HB me të njëjtin model lidhjeje disulfide si IZUMO1 (Figurat 3a dhe S11), megjithëse atyre u mungon një domen i ngjashëm me Ig.Supozohet se IZUMO2 dhe IZUMO3 janë proteina membranore të njëanshme të ngjashme me IZUMO1, ndërsa IZUMO4 duket se sekretohet.Funksionet e proteinave IZUMO 2, 3 dhe 4 në bashkimin e gameteve nuk janë përcaktuar.Dihet se IZUMO3 luan një rol në biogjenezën e akrozomit gjatë zhvillimit të spermës51 dhe proteina IZUMO është gjetur se formon një kompleks50.Ruajtja e proteinave IZUMO te gjitarët, zvarranikët dhe amfibët sugjeron që funksioni i tyre i mundshëm është në përputhje me atë të proteinave të tjera të njohura të lidhura me shkrirjen e gameteve, si DCST1/2, SOF1 dhe FIMP.
Diagrami i arkitekturës së domenit të superfamiljes IST, me domene 4HB, menteshë dhe të ngjashme me Ig të theksuara përkatësisht në portokalli, jeshile dhe blu.IZUMO4 ka një rajon unik C-terminal që duket i zi.Lidhjet disulfide të konfirmuara dhe të supozuara tregohen përkatësisht me vija të forta dhe me pika.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1) dhe DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) shfaqen në të njëjtin gamë ngjyrash si paneli A. Lidhjet disulfide tregohen në ngjyrë të purpurt.Spiralet transmembranore TMEM95, IZUMO2 dhe IZUMO3 nuk tregohen.
Ndryshe nga proteina IZUMO, proteinat e tjera SPACA (dmth. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 dhe SPACA9) mendohet të jenë strukturore të ndryshme nga SPACA6 (Fig. S12).Vetëm SPACA9 ka 4HB, por nuk pritet të ketë të njëjtin orientim paralel-anti-paralel ose të njëjtën lidhje disulfide si SPACA6.Vetëm SPACA1 ka një domen të ngjashëm të ngjashëm me Ig.AlphaFold parashikon që SPACA3, SPACA4 dhe SPACA5 kanë një strukturë krejtësisht të ndryshme nga SPACA6.Është interesante se SPACA4 dihet gjithashtu se luan një rol në fekondim, por në një masë më të madhe se SPACA6, në vend që lehtëson ndërveprimin midis spermës dhe zonës pellucida të ovocitit52.
Kërkimi ynë AlphaFold gjeti një tjetër përputhje për IZUMO1 dhe SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, një proteinë transmembranore e vetme specifike e spermës, i bën minjtë meshkuj infertilë kur hiqen 32,33.Spermatozoidet pa TMEM95 kishin morfologji normale, lëvizshmëri dhe aftësi për të depërtuar në zonën pellucida dhe për t'u lidhur me membranën e vezës, por nuk mund të shkriheshin me membranën e vezës.Studimet e mëparshme kanë treguar se TMEM95 ndan ngjashmëri strukturore me IZUMO133.Në të vërtetë, modeli AlphaFold konfirmoi se TMEM95 është një 4HB me të njëjtin çift motivesh CXXC si IZUMO1 dhe SPACA6 dhe të njëjtën lidhje shtesë disulfide midis spiraleve 1 dhe 2 që gjenden në SPACA6 (Fig. 3a dhe S11).Megjithëse TMEM95 i mungon një domen i ngjashëm me Ig, ai ka një rajon me një model lidhjeje disulfide të ngjashme me rajonet e menteshës SPACA6 dhe IZUMO1 (Fig. 3b).Në kohën e publikimit të këtij dorëshkrimi, serveri i paraprintimit raportoi strukturën e TMEM95, duke konfirmuar rezultatin AlphaFold53.TMEM95 është shumë i ngjashëm me SPACA6 dhe IZUMO1 dhe është ruajtur në mënyrë evolucionare tashmë te amfibët (Fig. 4 dhe S13).
Kërkimi PSI-BLAST përdori bazat e të dhënave NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP dhe SOF1 për të përcaktuar pozicionin e këtyre sekuencave në pemën e jetës.Distancat midis pikave të degëve nuk tregohen në shkallë.
Ngjashmëria e përgjithshme strukturore e habitshme midis SPACA6 dhe IZUMO1 sugjeron që ata janë anëtarë themelues të një superfamiljeje strukturore të konservuar që përfshin proteinat TMEM95 dhe IZUMO 2, 3 dhe 4.anëtarë të njohur: IZUMO1, SPACA6 dhe TMEM95.Për shkak se vetëm disa anëtarë zotërojnë domene të ngjashme me Ig, shenja dalluese e superfamiljes IST është domeni 4HB, i cili ka veçori unike të përbashkëta për të gjitha këto proteina: 1) 4HB i mbështjellë me spirale të renditura në një alternim anti-paralel/paralel (Fig. . 5a), 2) tufa ka një faqe trekëndore të përbërë nga dy spirale brenda tufës dhe një spirale e tretë vertikale (Fig. zona kryesore (Fig. 5c). Motivi CXXC, i gjetur në proteinat e ngjashme me tioredoksinën, dihet se funksionon si një sensor redoks 54,55,56, ndërsa motivi në anëtarët e familjes IST mund të shoqërohet me izomeraza disulfide proteinike si ERp57 në shkrirjen e gameteve.Rolet janë të lidhura 57,58.
Anëtarët e superfamiljes IST përcaktohen nga tre tipare karakteristike të domenit 4HB: katër spirale të alternuara midis orientimit paralel dhe antiparalel, faqet spirale ba-trekëndore dhe një motiv i dyfishtë ca CXXC i formuar midis molekulave të vogla.) Spiralet N-terminale (portokalli) dhe rajoni i menteshës β-fuke (jeshile).
Duke pasur parasysh ngjashmërinë midis SPACA6 dhe IZUMO1, u testua aftësia e të parës për t'u lidhur me IZUMO1 ose JUNO.Interferometria e bishtresave (BLI) është një metodë lidhëse me bazë kinetike që është përdorur më parë për të përcaktuar sasinë e ndërveprimit midis IZUMO1 dhe JUNO.Pas inkubimit të sensorit të etiketuar me biotinë me IZUMO1 si karrem me një përqendrim të lartë të analitit JUNO, u zbulua një sinjal i fortë (Fig. S14a), që tregon një ndryshim të shkaktuar nga lidhja në trashësinë e biomaterialit të ngjitur në majën e sensorit.Sinjale të ngjashme (dmth. JUNO i shoqëruar me sensorin si karrem kundër analitit IZUMO1) (Fig. S14b).Asnjë sinjal nuk u zbulua kur SPACA6 u përdor si një analit kundër IZUMO1 të lidhur me sensor ose JUNO të lidhur me sensor (Figura S14a,b).Mungesa e këtij sinjali tregon se domeni jashtëqelizor i SPACA6 nuk ndërvepron me domenin jashtëqelizor të IZUMO1 ose JUNO.
Për shkak se analiza BLI bazohet në biotinilimin e mbetjeve të lizinës së lirë në proteinën e karremit, ky modifikim mund të parandalojë lidhjen nëse mbetjet e lizinës përfshihen në ndërveprim.Përveç kësaj, orientimi i lidhjes në lidhje me sensorin mund të krijojë pengesa sterike, kështu që analizat konvencionale të tërheqjes u kryen gjithashtu në ektodominet rekombinante SPACA6, IZUMO1 dhe JUNO.Pavarësisht kësaj, SPACA6 nuk precipitoi me IZUMO1 të etiketuar me His ose JUNO të etiketuar me His (Fig. S14c, d), duke treguar asnjë ndërveprim në përputhje me atë të vërejtur në eksperimentet BLI.Si një kontroll pozitiv, ne konfirmuam ndërveprimin e JUNO me IZUMO1 të etiketuar (Figura S14e dhe S15).
Pavarësisht ngjashmërisë strukturore midis SPACA6 dhe IZUMO1, paaftësia e SPACA6 për të lidhur JUNO nuk është befasuese.Sipërfaqja e IZUMO1 njerëzore ka më shumë se 20 mbetje që ndërveprojnë me JUNO, duke përfshirë mbetjet nga secili prej tre rajoneve (edhe pse shumica e tyre ndodhen në rajonin e menteshës) (Fig. S14f).Nga këto mbetje, vetëm një është ruajtur në SPACA6 (Glu70).Ndërsa shumë zëvendësime të mbetjeve ruajtën vetitë e tyre origjinale biokimike, mbetja thelbësore e Arg160 në IZUMO1 u zëvendësua nga Asp148 e ngarkuar negativisht në SPACA6;Studimet e mëparshme kanë treguar se mutacioni Arg160Glu në IZUMO1 pothuajse tërësisht e zhduk lidhjen me JUNO43.Për më tepër, ndryshimi në orientimin e domenit midis IZUMO1 dhe SPACA6 rriti ndjeshëm sipërfaqen e zonës së lidhjes JUNO të rajonit ekuivalent në SPACA6 (Fig. S14g).
Megjithë nevojën e njohur për SPACA6 për shkrirjen e gameteve dhe ngjashmërinë e tij me IZUMO1, SPACA6 nuk duket të ketë një funksion lidhës ekuivalent JUNO.Prandaj, ne kemi kërkuar të kombinojmë të dhënat tona strukturore me dëshmitë e rëndësisë së ofruar nga biologjia evolucionare.Rreshtimi i sekuencës së homologëve SPACA6 tregon ruajtjen e strukturës së përbashkët përtej gjitarëve.Për shembull, mbetjet e cisteinës janë të pranishme edhe në amfibët e lidhur larg (Fig. 6a).Duke përdorur serverin ConSurf, të dhënat e mbajtjes së rreshtimit të shumëfishtë të sekuencave të 66 sekuencave u hartuan në sipërfaqen SPACA6.Ky lloj analize mund të tregojë se cilat mbetje janë ruajtur gjatë evolucionit të proteinave dhe mund të tregojë se cilat rajone sipërfaqësore luajnë një rol në funksion.
një rreshtim i sekuencës së ektodominave SPACA6 nga 12 lloje të ndryshme të përgatitura duke përdorur CLUSTAL OMEGA.Sipas analizës ConSurf, pozicionet më konservatore janë shënuar me blu.Mbetjet e cisteinës janë të theksuara me të kuqe.Kufijtë e domenit dhe elementët e strukturës dytësore tregohen në krye të shtrirjes, ku shigjetat tregojnë fillesat β dhe valët tregojnë spirale.Identifikuesit e hyrjes NCBI që përmbajnë sekuencat janë: njerëzore (homo sapiens, np_001303901), mandrill (mandrilus leucophaeus, xp_011821277), capuchin majmun (cebus mimic, xp_017359363 _23 xp_032_034).), dele (Ovis aries, XP_014955560), elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), qen (Canis lupus familyis, XP_025277208), miu (Mus musculus, NP_001156manianph101), , XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 dhe Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numërimi bazohet në rendin njerëzor.b Paraqitja sipërfaqësore e strukturës SPACA6 me 4HB në krye dhe domen të ngjashëm me Ig në fund, ngjyra të bazuara në vlerësimet e ruajtjes nga serveri ConSurf.Pjesët më të ruajtura janë në ngjyrë blu, pjesët e ruajtura mesatarisht janë në ngjyrë të bardhë dhe ato më pak të ruajtura janë në ngjyrë të verdhë.cisteinë vjollcë.Tre arna sipërfaqësore që demonstrojnë një nivel të lartë mbrojtjeje tregohen në pjesët hyrëse të etiketuara 1, 2 dhe 3. Një karikaturë 4HB shfaqet në pjesën e sipërme djathtas (e njëjta skemë ngjyrash).
Struktura SPACA6 ka tre zona sipërfaqësore shumë të konservuara (Fig. 6b).Patch 1 përfshin 4HB dhe rajonin e menteshës dhe përmban dy ura disulfide të konservuara CXXC, një rrjet menteshë Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) dhe tre mbetje aromatike të jashtme të konservuara (Phe31, Tyr73, Phe137).një buzë më e gjerë e domenit të ngjashëm me Ig (Fig. S6e), e cila përfaqëson disa mbetje të ngarkuara pozitivisht në sipërfaqen e spermës.Është interesante se ky copëz përmban një epitop antitrupash që më parë është treguar se ndërhyn në funksionin e SPACA6 30.Rajoni 3 përfshin menteshën dhe njërën anë të domenit të ngjashëm me Ig;ky rajon përmban prolina të konservuara (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) dhe mbetje polare/të ngarkuara me pamje nga jashtë.Çuditërisht, shumica e mbetjeve në sipërfaqen e 4HB janë shumë të ndryshueshme (Fig. 6b), megjithëse palosja ruhet në të gjithë homologun SPACA6 (siç tregohet nga konservatorizmi i bërthamës së paketës hidrofobike) dhe përtej superfamiljes IST.
Megjithëse ky është rajoni më i vogël në SPACA6 me më pak elementë të strukturës dytësore të dallueshme, shumë mbetje të rajonit të menteshës (përfshirë rajonin 3) janë shumë të ruajtura midis homologëve SPACA6, gjë që mund të tregojë se orientimi i paketës spirale dhe β-sanduiçit luan një rol.si një konservator.Megjithatë, megjithë lidhjet e gjera hidrogjenore dhe rrjetet elektrostatike në rajonin e menteshës së SPACA6 dhe IZUMO1, prova e fleksibilitetit të brendshëm mund të shihet në shtrirjen e strukturave të shumta të lejuara të IZUMO137,43,44.Rreshtimi i domeneve individuale mbivendosej mirë, por orientimi i domeneve në lidhje me njëri-tjetrin varionte nga 50° në 70° nga boshti qendror (Fig. S16).Për të kuptuar dinamikën konformacionale të SPACA6 në tretësirë, u kryen eksperimente SAXS (Fig. S17a,b).Rindërtimi ab initio i ektodominit SPACA6 përputhej me një strukturë kristalore me shufër (Fig. S18), megjithëse grafiku i Kratky tregoi një shkallë fleksibiliteti (Fig. S17b).Ky konformacion është në kontrast me IZUMO1, në të cilin proteina e palidhur merr një formë bumerang si në rrjetë ashtu edhe në tretësirë43.
Për të identifikuar në mënyrë specifike rajonin fleksibël, u krye spektroskopia e masës hidrogjen-deuterium (H-DXMS) në SPACA6 dhe u krahasua me të dhënat e marra më parë në IZUMO143 (Fig. 7a,b).SPACA6 është qartësisht më fleksibël se IZUMO1, siç dëshmohet nga shkëmbimi më i lartë i deuteriumit në të gjithë strukturën pas 100,000 s shkëmbimi.Në të dyja strukturat, pjesa C-terminale e rajonit të menteshës tregon një nivel të lartë shkëmbimi, i cili ndoshta lejon rrotullim të kufizuar të domeneve 4HB dhe të ngjashme me Ig në lidhje me njëri-tjetrin.Është interesante se pjesa C-terminale e menteshës SPACA6, e përbërë nga mbetja 147CDLPLDCP154, është një rajon shumë i ruajtur 3 (Fig. 6b), ndoshta duke treguar se fleksibiliteti i interdomaineve është një veçori e ruajtur në mënyrë evolucionare e SPACA6.Sipas analizës së fleksibilitetit, të dhënat e shkrirjes termike të CD-së treguan se SPACA6 (Tm = 51,2°C) është më pak i qëndrueshëm se IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Fig. S1e dhe S19).
a imazhe H-DXMS të SPACA6 dhe b IZUMO1.Përqindja e shkëmbimit të deuteriumit u përcaktua në pikat kohore të treguara.Nivelet e shkëmbimit hidrogjen-deuterium tregohen me ngjyra në një shkallë gradienti nga blu (10%) në të kuqe (90%).Kutitë e zeza përfaqësojnë zona të shkëmbimit të lartë.Kufijtë e 4HB, menteshës dhe domenit të ngjashëm me Ig të vëzhguar në strukturën kristalore tregohen mbi sekuencën parësore.Nivelet e shkëmbimit të deuteriumit në 10 s, 1000 s dhe 100,000 s u skicuan në një tabelë shiritash të mbivendosur në sipërfaqet molekulare transparente të SPACA6 dhe IZUMO1.Pjesët e strukturave me një nivel shkëmbimi deuterium nën 50% janë me ngjyrë të bardhë.Zonat mbi 50% të shkëmbimit H-DXMS janë ngjyrosur në një shkallë gradient.
Përdorimi i CRISPR/Cas9 dhe strategjive gjenetike të nokautit të gjeneve të miut ka çuar në identifikimin e disa faktorëve të rëndësishëm për lidhjen dhe shkrirjen e spermës dhe vezëve.Përveç ndërveprimit të mirë-karakterizuar të strukturës IZUMO1-JUNO dhe CD9, shumica e proteinave të lidhura me shkrirjen e gameteve mbeten enigmatike strukturore dhe funksionale.Karakterizimi biofizik dhe strukturor i SPACA6 është një pjesë tjetër e enigmës molekulare të ngjitjes/bashkimit gjatë fekondimit.
SPACA6 dhe anëtarët e tjerë të superfamiljes IST duket se janë shumë të konservuar tek gjitarët, si dhe tek zogjtë individualë, zvarranikët dhe amfibët;në fakt, mendohet se SPACA6 kërkohet edhe për fekondim te zebrafish 59. Kjo shpërndarje është e ngjashme me proteinat e tjera të njohura të lidhura me bashkimin e gameteve si DCST134, DCST234, FIMP31 dhe SOF132, duke sugjeruar që këta faktorë janë të mangët në HAP2 (gjithashtu të njohura si GCS1) proteina që janë përgjegjëse për aktivitetin katalitik të shumë protistëve., bimët dhe artropodët.Proteinat e bashkimit të fekonduara 60, 61. Pavarësisht nga ngjashmëria e fortë strukturore midis SPACA6 dhe IZUMO1, nokauti i gjeneve që kodojnë njërën prej këtyre proteinave rezultoi në infertilitet te minjtë meshkuj, duke treguar se funksionet e tyre në shkrirjen e gameteve nuk janë të dyfishta..Më gjerësisht, asnjë nga proteinat e njohura të spermës që kërkohen për fazën e ngjitjes së shkrirjes nuk është e tepërt.
Mbetet një pyetje e hapur nëse SPACA6 (dhe anëtarët e tjerë të superfamiljes IST) marrin pjesë në nyjet ndërgametike, formojnë rrjete intragametike për të rekrutuar proteina të rëndësishme në pikat e shkrirjes, apo ndoshta edhe veprojnë si fuzogjene të pakapshme.Studimet e bashkë-imunoprecipitimit në qelizat HEK293T zbuluan një ndërveprim midis IZUMO1 me gjatësi të plotë dhe SPACA632.Sidoqoftë, ektodominat tona rekombinante nuk ndërvepruan in vitro, duke sugjeruar se ndërveprimet e parë në Noda et al.u fshinë të dyja në konstrukt (vini re bishtin citoplazmatik të IZUMO1, i cili është treguar i panevojshëm për fekondim62).Përndryshe, IZUMO1 dhe/ose SPACA6 mund të kërkojnë mjedise lidhëse specifike që ne nuk i riprodhojmë in vitro, si p.sh. konformacione fiziologjikisht specifike ose komplekse molekulare që përmbajnë proteina të tjera (të njohura ose të pazbuluara ende).Megjithëse ektodomina IZUMO1 besohet se ndërmjetëson lidhjen e spermatozoideve me vezën në hapësirën periviteline, qëllimi i ektodominit SPACA6 është i paqartë.
Struktura e SPACA6 zbulon disa sipërfaqe të konservuara që mund të përfshihen në ndërveprimet protein-proteinë.Pjesa e konservuar e rajonit të menteshës menjëherë ngjitur me motivin CXXC (e caktuar Patch 1 më lart) ka disa mbetje aromatike me pamje nga jashtë, të cilat shpesh shoqërohen me ndërveprime hidrofobike dhe të grumbullimit π midis biomolekulave.Anët e gjera të domenit të ngjashëm me Ig (rajoni 2) formojnë një brazdë të ngarkuar pozitivisht me Arg dhe mbetje të tij shumë të konservuara, dhe antitrupat kundër këtij rajoni janë përdorur më parë për të bllokuar shkrirjen e gameteve 30 .Antitrupi njeh epitopin linear 212RIRPAQLTHRGTFS225, i cili ka tre nga gjashtë mbetjet e argininës dhe His220 shumë të konservuar.Nuk është e qartë nëse mosfunksionimi është për shkak të bllokimit të këtyre mbetjeve specifike apo të gjithë rajonit.Vendndodhja e këtij hendeku pranë C-terminusit të β-sanduiçit tregon ndërveprimet cis me proteinat fqinje të spermës, por jo me proteinat e vezëve.Për më tepër, mbajtja e një lëmshi shumë fleksibël të pasur me prolinë (vendi 3) brenda varëses mund të jetë vendi i një ndërveprimi protein-proteinë ose, më shumë gjasa, të tregojë mbajtjen e fleksibilitetit midis dy fushave.Gjinia është e rëndësishme për rolin e panjohur të SPACA6.bashkimi i gameteve.
SPACA6 ka vetitë e proteinave të ngjitjes ndërqelizore, duke përfshirë β-sanduiçe të ngjashme me Ig.Shumë proteina ngjitëse (p.sh., kadherinat, integrinat, adhezinat dhe IZUMO1) zotërojnë një ose më shumë domene β-sanduiç që zgjerojnë proteinat nga membrana qelizore në objektivat e tyre mjedisore63,64,65.Domeni Ig-si i SPACA6 përmban gjithashtu një motiv që zakonisht gjendet në β-sanduiçët e ngjitjes dhe kohezionit: dyshe fijesh paralele në skajet e β-sanduiçëve, të njohur si kapëse mekanike66.Besohet se ky motiv rrit rezistencën ndaj forcave prerëse, e cila është e vlefshme për proteinat e përfshira në ndërveprimet ndërqelizore.Megjithatë, pavarësisht nga kjo ngjashmëri me adhezinat, aktualisht nuk ka asnjë provë që SPACA6 ndërvepron me të bardhat e vezëve.Ektodomina SPACA6 nuk është në gjendje të lidhet me JUNO dhe qelizat HEK293T që shprehin SPACA6, siç tregohet këtu, vështirë se ndërveprojnë me ovocitet që u mungon zona 32 .Nëse SPACA6 krijon lidhje ndërgametike, këto ndërveprime mund të kërkojnë modifikime pas përkthimit ose të stabilizohen nga proteinat e tjera të spermës.Në mbështetje të hipotezës së fundit, spermatozoidet me mungesë IZUMO1 lidhen me ovocitet, duke demonstruar se molekulat e tjera përveç IZUMO1 janë të përfshira në hapin 27 të ngjitjes së gameteve.
Shumë proteina të shkrirjes virale, qelizore dhe zhvillimore kanë veti që parashikojnë funksionin e tyre si fuzogjene.Për shembull, glikoproteinat e shkrirjes virale (klasat I, II dhe III) kanë një peptid ose lak të shkrirjes hidrofobike në fund të proteinës që futet në membranën e bujtësit.Harta e hidrofilitetit të IZUMO143 dhe struktura (e përcaktuar dhe e parashikuar) e superfamiljes IST nuk tregoi asnjë peptid të dukshëm të shkrirjes hidrofobike.Kështu, nëse ndonjë proteinë në superfamiljen IST funksionon si fuzogjene, ato e bëjnë këtë në një mënyrë të ndryshme nga shembujt e tjerë të njohur.
Si përfundim, funksionet e anëtarëve të superfamiljes IST të proteinave të lidhura me shkrirjen e gameteve mbeten një mister tërheqës.Molekula jonë rekombinante e karakterizuar SPACA6 dhe struktura e saj e zgjidhur do të ofrojnë një pasqyrë të marrëdhënieve midis këtyre strukturave të përbashkëta dhe rolit të tyre në lidhjen dhe shkrirjen e gameteve.
Sekuenca e ADN-së që korrespondon me ektodominën e parashikuar të SPACA6 njerëzore (numri i hyrjes NCBI NP_001303901.1; mbetjet 27-246) u optimizua me kodon për shprehjen në qelizat Drosophila melanogaster S2 dhe u sintetizua si një gjen me sekuencën e fragmenteve GenicsE (kozaknom E koduar)., sinjali i sekretimit BiP dhe skajet përkatëse 5' dhe 3' për klonimin e pavarur nga lidhja e këtij gjeni në një vektor shprehjeje pMT bazuar në një promotor metalotioneinë të modifikuar për përzgjedhje me puromycin (pMT-puro).Vektori pMT-puro kodon një vend të ndarjes së trombinës pasuar nga një etiketë C-terminale 10x-His (Figura S2).
Transfektimi i qëndrueshëm i vektorit SPACA6 pMT-puro në qelizat D. melanogaster S2 (Gibco) u krye në mënyrë të ngjashme me protokollin e përdorur për IZUMO1 dhe JUNO43.Qelizat S2 u shkrinë dhe u rritën në mjedisin e Schneider-it (Gibco) të plotësuar me një përqendrim përfundimtar prej 10% (v/v) serum fetusi të viçit të inaktivuar nga nxehtësia (Gibco) dhe antibiotik antimikotik 1X (Gibco).Qelizat e kalimit të hershëm (3.0 x 106 qeliza) u vendosën në puse individuale të pllakave me 6 pus (Corning).Pas 24 orësh inkubimi në 27°C, qelizat u transfektuan me një përzierje prej 2 mg të vektorit pMT-puro SPACA6 dhe reagentit transfektues Effectene (Qiagen) sipas protokollit të prodhuesit.Qelizat e transfektuara u inkubuan për 72 orë dhe më pas u grumbulluan me 6 mg/ml puromycin.Qelizat u izoluan më pas nga mediumi i plotë i Schneider-it dhe u vendosën në mjedisin pa serum Insect-XPRESS (Lonza) për prodhimin e proteinave në shkallë të gjerë.Një grumbull 1 L i kulturës qelizore S2 u rrit në 8-10 × 106 ml-1 qeliza në një balonë Erlenmeyer polipropileni me fund të sheshtë të ventiluar 2 L dhe më pas u sterilizua me një përqendrim përfundimtar prej 500 μM CuSO4 (Millipore Sigma) dhe u filtua steril.e nxitur.Kulturat e induktuara u inkubuan në 27° C. në 120 rpm për katër ditë.
Mjeti i kondicionuar që përmban SPACA6 u izolua me centrifugim në 5660 × g në 4°C i ndjekur nga një sistem filtrimi i rrjedhës tangjenciale Centramate (Pall Corp) me një membranë MWCO 10 kDa.Aplikoni medium të koncentruar që përmban SPACA6 në një kolonë 2 ml rrëshirë agaroze Ni-NTA (Qiagen).Rrëshira Ni-NTA u la me 10 vëllime kolone (CV) të buferit A dhe më pas u shtua 1 CV e buferit A për të dhënë një përqendrim përfundimtar të imidazolit prej 50 mM.SPACA6 u eluat me 10 ml bufer A të plotësuar me imidazol deri në një përqendrim përfundimtar prej 500 mM.Trombina e klasës së kufizuar (Millipore Sigma) u shtua drejtpërdrejt në tubin e dializës (MWCO 12-14 kDa) në 1 njësi për mg SPACA6 kundrejt 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 dhe 150 mM NaCl (bufer B) për dializë.) në 4°C për 48 orë.SPACA6 i copëtuar nga trombina u hollua tre herë për të reduktuar përqendrimin e kripës dhe u ngarkua në një kolonë shkëmbimi kationesh 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) e ekuilibruar me 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Shkëmbyesi i kationit u la me 3 CV prej 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, më pas SPACA6 u eluat me një gradient linear prej 0 deri në 500 mM NaCl në 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 për 25 CV.Pas kromatografisë së shkëmbimit të joneve, SPACA6 u përqendrua në 1 ml dhe u eluat në mënyrë izokratike nga një kolonë ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) e ekuilibruar me tampon B. Sipas kromatogramit, fraksionet e grupit dhe koncentratit që përmbajnë SPACA6.Pastërtia u kontrollua nga elektroforeza e ngjyrosur me Coomassie në një xhel 16% SDS-polyakrilamid.Përqendrimi i proteinave u përcaktua me përthithje në 280 nm duke përdorur ligjin Beer-Lambert dhe koeficientin teorik të zhdukjes molare.
SPACA6 i pastruar u dializua gjatë natës kundër 10 mM fosfat natriumi, pH 7.4 dhe 150 mM NaF dhe u hollua në 0.16 mg/mL përpara analizës me spektroskopi CD.Skanimi spektral i CD-ve me një gjatësi vale nga 185 deri në 260 nm u mblodh në një spektropolarimetër Jasco J-1500 duke përdorur kuveta kuarci me një gjatësi shtegu optik 1 mm (Helma) në 25°C me një shpejtësi 50 nm/min.Spektrat CD u korrigjuan në bazë, u vlerësuan mesatarisht mbi 10 blerje dhe u konvertuan në elipticitetin mesatar të mbetur (θMRE) në gradë cm2/dmol:
ku MW është pesha molekulare e çdo kampioni në Da;N është numri i aminoacideve;θ është elipticiteti në miligradë;d korrespondon me gjatësinë e shtegut optik në cm;përqendrimi i proteinave në njësi.