304 Tub me mbështjellje të salduar prej çeliku të pandryshkshëm / zomponent zhemik i tubit, Potenciali biosintetik i mikrobiomës globale detare

Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Rrëshqitës që tregojnë tre artikuj për rrëshqitje.Përdorni butonat e pasëm dhe të ardhshëm për të lëvizur nëpër rrëshqitje, ose butonat e kontrolluesit të rrëshqitjes në fund për të lëvizur nëpër secilën rrëshqitje.

Përshkrimi i detajuar i produktit

304 Tub/tub me mbështjellje të salduar prej çeliku inox
1. Specifikimi: Tub/tub me spirale çeliku inox
2. Lloji: i salduar ose pa qepje
3. Standardi: ASTM A269, ASTM A249
4. Tub me spirale inox OD: 6mm deri në 25.4MM
5. Gjatësia: 600-3500MM ose sipas kërkesës së klientit.
6. Trashësia e murit: 0.2mm deri në 2.0mm.

7. Toleranca: OD: +/-0.01mm;Trashësia: +/-0,01%.

8. Madhësia e vrimës së brendshme të spirales: 500MM-1500MM (mund të rregullohet sipas kërkesave të klientit)

9. Lartësia e spirales: 200MM-400MM (mund të rregullohet sipas kërkesave të klientit)

10. Sipërfaqja: e ndritshme ose e pjekur
11. Materiali: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, aliazh 625, 825, 2205, 2507, etj.
12. Paketimi: çanta të endura në kuti druri, paletë druri, bosht druri, ose sipas kërkesës së klientit
13. Testi: komponenti kimik, forca e rendimentit, forca në tërheqje, matja e fortësisë
14. Garancia: Inspektimi i palës së tretë (për shembull :SGS TV ) etj.
15. Aplikimi: Dekorim, mobilje, transport vaji, këmbyes nxehtësie, kangjella, punim letre, automobil, përpunim ushqimor, mjekësi etj.

Komunitetet natyrore mikrobike janë filogjenetike dhe metabolike të ndryshme.Përveç grupeve të nënstudiuara të organizmave1, ky diversitet përmban gjithashtu një potencial të pasur për zbulimin e enzimave dhe komponimeve biokimike të rëndësishme ekologjikisht dhe bioteknologjikisht2,3.Megjithatë, studimi i këtij diversiteti për të përcaktuar rrugët gjenomike që sintetizojnë komponime të tilla dhe i lidhin ato me bujtësit e tyre përkatës mbetet një sfidë.Potenciali biosintetik i mikroorganizmave në oqeanin e hapur mbetet kryesisht i panjohur për shkak të kufizimeve në analizën e të dhënave të të gjithë rezolucionit të gjenomit në shkallë globale.Këtu, ne eksplorojmë diversitetin dhe diversitetin e grupimeve të gjeneve biosintetike në oqean duke integruar rreth 10,000 gjenoma mikrobike nga qelizat e kultivuara dhe qelizat e vetme me më shumë se 25,000 gjenome të reja të rindërtuara nga mbi 1,000 mostra të ujit të detit.Këto përpjekje kanë identifikuar rreth 40,000 grupime gjenesh të supozuara kryesisht të reja biosintetike, disa prej të cilave janë gjetur në grupe filogjenetike të padyshuara më parë.Në këto popullata, ne identifikuam një linjë të pasuruar me grupe gjenesh biosintetike ("Candidatus Eudormicrobiaceae") që i përkisnin një grupi bakterial të pakultivuar dhe përfshinin disa nga mikroorganizmat më të ndryshëm biosintetikisht në këtë mjedis.Nga këto, ne kemi karakterizuar rrugët fosfatazë-peptide dhe pitonamide, duke identifikuar raste të strukturës dhe enzimologjisë së pazakontë të përbërjes bioaktive, përkatësisht.Si përfundim, ky studim tregon se si strategjitë e bazuara në mikrobiomën mund të mundësojnë eksplorimin e enzimave dhe ushqimeve natyrale të papërshkruara më parë në një mikrobiotë dhe mjedis të kuptuar keq.
Mikrobet drejtojnë ciklet globale biogjeokimike, ruajnë rrjetat ushqimore dhe mbajnë të shëndetshme bimët dhe kafshët5.Diversiteti i tyre i madh filogjenetik, metabolik dhe funksional paraqet një potencial të pasur për zbulimin e taksoneve1, enzimave dhe komponimeve biokimike të reja, duke përfshirë produktet natyrore6.Në bashkësitë ekologjike, këto molekula u ofrojnë mikroorganizmave një sërë funksionesh fiziologjike dhe ekologjike, nga komunikimi deri te konkurrenca 2, 7 .Përveç funksioneve të tyre origjinale, këto produkte natyrore dhe rrugët e tyre të prodhimit të koduara gjenetikisht ofrojnë shembuj për aplikime bioteknologjike dhe terapeutike2,3.Identifikimi i rrugëve dhe lidhjeve të tilla është lehtësuar shumë nga studimi i mikrobeve të kultivuara.Megjithatë, studimet taksonomike të mjediseve natyrore kanë treguar se shumica dërrmuese e mikroorganizmave nuk janë kultivuar8.Ky paragjykim kulturor kufizon aftësinë tonë për të shfrytëzuar diversitetin funksional të koduar nga shumë mikrobe4,9.
Për të kapërcyer këto kufizime, përparimet teknologjike gjatë dekadës së fundit i kanë lejuar studiuesit të renditin drejtpërdrejt (d.m.th., pa kulturë paraprake) fragmente të ADN-së mikrobike nga komunitete të tëra (metagenomics) ose qeliza të vetme.Aftësia për të mbledhur këto fragmente në fragmente më të mëdha gjenomi dhe për të rindërtuar gjenome të shumta të montuara metagjenomikisht (MAG) ose gjenome të vetme të përforcuara (SAGs), respektivisht, hap një mundësi të rëndësishme për studime taksocentrike të mikrobiomës (dmth., komunitetet mikrobike dhe mikrobiomën).shtrojnë shtigje të reja.materialin e vet gjenetik në një mjedis të caktuar) 10,11,12.Në të vërtetë, studimet e fundit kanë zgjeruar në masë të madhe përfaqësimin filogjenetik të diversitetit mikrobik në Tokë1, 13 dhe kanë zbuluar një pjesë të madhe të diversitetit funksional në bashkësitë individuale mikrobike që nuk mbuloheshin më parë nga sekuencat e gjenomit të referencës së mikroorganizmave të kultivuara (REFs)14.Aftësia për të vendosur diversitetin funksional të pazbuluar në kontekstin e gjenomit pritës (dmth, rezolucioni i gjenomit) është kritike për parashikimin e linjave mikrobike ende të pakarakterizuara që me sa duket kodojnë produkte të reja natyrore15,16 ose për gjurmimin e komponimeve të tilla tek prodhuesi i tyre origjinal17.Për shembull, një qasje e kombinuar e analizës gjenomike metagjenomike dhe njëqelizore ka çuar në identifikimin e Candidatus Entotheonella, një grup bakteresh të lidhura me sfungjer të pasur metabolikisht, si prodhues të një sërë potencialesh medikamentesh18.Megjithatë, pavarësisht përpjekjeve të fundit për eksplorimin gjenomik të komuniteteve të ndryshme mikrobiale,16,19 më shumë se dy të tretat e të dhënave globale metagjenomike për oqeanin më të madh të ekosistemeve të Tokës16,20 ende mungojnë.Kështu, në përgjithësi, potenciali biosintetik i mikrobiomës detare dhe potenciali i tij si një depo e produkteve të reja enzimatike dhe natyrore mbeten kryesisht të nënstudiuara.
Për të eksploruar potencialin biosintetik të mikrobiomeve detare në një shkallë globale, ne fillimisht grumbulluam gjenomet mikrobiale detare të marra duke përdorur metoda të varura nga kultura dhe jo-kulturore për të krijuar një bazë të dhënash të gjerë të filogjenetikës dhe funksionit të gjeneve.Ekzaminimi i kësaj baze të dhënash zbuloi një shumëllojshmëri të gjerë të grupimeve të gjeneve biosintetike (BGCs), shumica e të cilave i përkasin familjeve ende të pakarakterizuara të grupeve të gjeneve (GCF).Përveç kësaj, ne identifikuam një familje të panjohur bakteriale që shfaq diversitetin më të lartë të njohur të BGC-ve në oqeanin e hapur deri më sot.Ne zgjodhëm dy rrugë të sintezës ribozomale dhe peptideve të modifikuara pas përkthimit (RiPP) për vërtetim eksperimental bazuar në dallimet e tyre gjenetike nga rrugët e njohura aktualisht.Karakterizimi funksional i këtyre rrugëve ka zbuluar shembuj të papritur të enzimologjisë, si dhe përbërje të pazakonta strukturore me aktivitet frenues të proteazës.
Në fillim, ne synuam të krijonim një burim global të të dhënave për analizën e gjenomit, duke u fokusuar në përbërësit e tij bakterialë dhe arkealë.Për këtë qëllim, ne grumbulluam të dhëna metagjenomike dhe 1038 mostra të ujit të detit nga 215 vende të marrjes së mostrave të shpërndara globalisht (varg gjerësie = 141.6°) dhe disa shtresa të thella (nga 1 deri në 5600 m në thellësi, që mbulojnë zonat pelagjike, mesopelagjike dhe humnere).Sfondi21,22,23 (Fig. 1a, të dhëna të zgjeruara, Fig. 1a dhe Tabela plotësuese 1).Përveç ofrimit të një mbulimi të gjerë gjeografik, këto mostra të filtruara në mënyrë selektive na lejuan të krahasonim përbërës të ndryshëm të mikrobiomës detare, duke përfshirë të pasur me viruse (<0,2 μm), të pasur me prokariote (0,2-3 μm), të pasur me grimca (0,8 μm ).–20 µm) dhe koloni të varfëruara nga viruset (>0.2 µm).
a, Një total prej 1038 gjenomash të disponueshme publikisht (metagenomikë) të komuniteteve mikrobiale detare të mbledhura nga 215 vende të shpërndara globalisht (62°S deri në 79°N dhe 179°V deri në 179°E .).Pllakat e hartës © Esri.Burimet: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ dhe Esri.b, këto metagjenome u përdorën për të rindërtuar MAG (metoda dhe informacion shtesë), të cilat ndryshojnë në sasi dhe cilësi (metoda) në grupet e të dhënave (të shënuara me ngjyra).MAG-të e rindërtuara u plotësuan me gjenome (të jashtme) të disponueshme publikisht, duke përfshirë MAG26, SAG27 dhe REF të punuara me dorë.27 Përpiloni OMD.c, krahasuar me raportet e mëparshme të bazuara vetëm në SAG (GORG)20 ose MAG (GEM)16, OMD përmirëson karakterizimin gjenomik të komuniteteve mikrobiale detare (shkalla e leximit metagjenomik të hartës; metoda) me dy deri në tre herë me përfaqësim më të qëndrueshëm në thellësi dhe gjerësi gjeografike..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, grupimi i OMD në grupe të nivelit të specieve (95% identiteti mesatar i nukleotideve) identifikon një total prej afërsisht 8300 lloje, më shumë se gjysma e të cilave nuk janë karakterizuar më parë sipas shënimeve taksonomike duke përdorur GTDB (versioni 89) e, klasifikimi i specieve sipas llojit të gjenomit tregoi se MAG, SAG dhe REF plotësojnë njëra-tjetrën mirë në pasqyrimin e diversitetit filogjenetik të mikrobiomën detare.Në veçanti, 55%, 26% dhe 11% e specieve ishin specifike për MAG, SAG dhe REF, respektivisht.Lakuriqët e natës, Seria kohore e Atlantikut të Bermudës;GEM, gjenomet e mikrobiomës së Tokës;GORG, gjenomi referues i oqeanit global;Seritë kohore HOT, Oqeani Havai.
Duke përdorur këtë grup të dhënash, ne rindërtuam një total prej 26,293 MAG, kryesisht bakteriale dhe arkeale (Fig. 1b dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 1b).Ne i krijuam këto MAG nga asambletë nga mostra metagjenomike të veçanta dhe jo të grumbulluara për të parandaluar kolapsin e ndryshimit të sekuencës natyrore midis mostrave nga vende të ndryshme ose pika kohore (metoda).Përveç kësaj, ne grupuam fragmente gjenomike bazuar në korrelacionet e tyre të prevalencës në një numër të madh mostrash (nga 58 në 610 mostra, në varësi të metodës së anketimit).Ne zbuluam se ky është një hap që kërkon kohë, por i rëndësishëm24, i cili u anashkalua në disa punime rindërtimi në shkallë të gjerë MAG16, 19, 25 dhe përmirëson ndjeshëm sasinë (2,7 herë mesatarisht) dhe cilësinë (+20% mesatarisht) të gjenomi.rindërtuar nga metagjenoma detare e studiuar këtu (të dhëna të zgjeruara, Fig. 2a dhe informacion shtesë).Në përgjithësi, këto përpjekje rezultuan në një rritje 4,5-fish të MAG-ve mikrobiale detare (6-fish nëse merren parasysh vetëm MAG-të me cilësi të lartë) krahasuar me burimin më gjithëpërfshirës MAG të disponueshëm sot16 (Metodat).Ky grup MAG i krijuar rishtazi u kombinua më pas me 830 MAG26 të zgjedhura me dorë, 5969 SAG27 dhe 1707 REF.Njëzet e shtatë lloje të baktereve detare dhe arkeave përbënin një koleksion të kombinuar prej 34,799 gjenomash (Fig. 1b).
Më pas vlerësuam burimin e krijuar rishtazi për të përmirësuar aftësinë e tij për të përfaqësuar komunitetet mikrobiale detare dhe për të vlerësuar ndikimin e integrimit të llojeve të ndryshme të gjenomit.Mesatarisht, ne zbuluam se mbulon afërsisht 40-60% të të dhënave metagjenomike detare (Figura 1c), dy deri në tre herë më shumë se mbulimi i raporteve të mëparshme vetëm për MAG, si në thellësi ashtu edhe në gjerësi. More serial 16 ose SAG20.Përveç kësaj, për të matur në mënyrë sistematike diversitetin taksonomik në koleksionet e krijuara, ne shënuam të gjitha gjenomet duke përdorur paketën (metodat) e bazës së të dhënave të taksonomisë së gjenomit (GTDB) dhe përdorëm një identitet mesatar të nukleotideve të gjenomit prej 95%.28 për të identifikuar 8,304 grupime (specie).Dy të tretat e këtyre specieve (përfshirë klladet e reja) nuk ishin shfaqur më parë në GTDB, nga të cilat 2790 u zbuluan duke përdorur MAG të rindërtuar në këtë studim (Fig. 1d).Përveç kësaj, ne zbuluam se lloje të ndryshme gjenomash janë shumë komplementare: 55%, 26% dhe 11% e specieve përbëhen tërësisht nga MAG, SAG dhe REF, respektivisht (Fig. 1e).Përveç kësaj, MAG mbuloi të gjitha 49 llojet e gjetura në kolonën e ujit, ndërsa SAG dhe REF përfaqësonin vetëm 18 dhe 11 prej tyre, respektivisht.Megjithatë, SAG përfaqëson më mirë diversitetin e kladeve më të zakonshme (të dhënat e zgjeruara, Fig. 3a), të tilla si Pelagic Bacteriales (SAR11), me SAG që mbulon pothuajse 1300 lloje dhe MAG vetëm 390 lloje.Veçanërisht, REF-të rrallë mbivendosen me MAG ose SAG në nivel speciesh dhe përfaqësonin >95% të përafërsisht 1000 gjenomeve që nuk gjenden në grupet metagjenomike të oqeanit të hapur të studiuar këtu, kryesisht për shkak të ndërveprimeve me lloje të tjera të ekzemplarëve të izoluar përfaqësues detarë (p.sh. sedimente). .ose mikpritës-bashkëpunëtor).Për ta bërë atë gjerësisht të disponueshëm për komunitetin shkencor, ky burim i gjenomit detar, i cili përfshin gjithashtu fragmente të paklasifikuara (p.sh., nga fagët e parashikuar, ishujt gjenomikë dhe fragmentet gjenomike për të cilat nuk ka të dhëna të mjaftueshme për rindërtimin e MAG), mund të krahasohet me të dhënat taksonomike. .Përdorni shënimet së bashku me funksionin e gjeneve dhe parametrat kontekstualë në bazën e të dhënave të mikrobiologjisë së oqeanit (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Më pas u nisëm për të eksploruar pasurinë dhe risinë e potencialit biosintetik në mikrobiomet e oqeanit të hapur.Për këtë qëllim, ne fillimisht përdorëm antiSMASH për të gjitha MAG-të, SAG-të dhe REF-të e gjetura në 1038 metagjenome (metoda) detare për të parashikuar një total prej 39,055 BGC.Më pas i grupuam këto në 6907 GCF jo të tepërta dhe 151 grupime gjenesh (GCC; Tabela Suplementare 2 dhe metoda) për të llogaritur tepricën e natyrshme (dmth., e njëjta BGC mund të kodohet në gjenome të shumta) dhe të dhëna metagjenomike Fragmentimi i BGC-ve të përqendruara.BGC-të jo të plota nuk e rritën ndjeshëm, nëse ka (Informacion Shtesë), numrin e GCF-ve dhe GCC-ve, përkatësisht, që përmbajnë të paktën një anëtar të paprekur BGC në 44% dhe 86% të rasteve.
Në nivelin GCC, ne gjetëm një shumëllojshmëri të gjerë të RiPP-ve të parashikuara dhe produkteve të tjera natyrore (Fig. 2a).Midis tyre, për shembull, arilpolyenet, karotenoidet, ektoinat dhe sideroforet i përkasin GCC-ve me një shpërndarje të gjerë filogjenetike dhe një bollëk të lartë në metagjenomet oqeanike, të cilat mund të tregojnë një përshtatje të gjerë të mikroorganizmave në mjedisin detar, duke përfshirë rezistencën ndaj specieve reaktive të oksigjenit. stresi oksidativ dhe osmotik..ose thithjen e hekurit (më shumë informacion).Ky diversitet funksional është në kontrast me një analizë të kohëve të fundit të afërsisht 1.2 milion BGC në mesin e afërsisht 190,000 gjenomave të ruajtura në bazën e të dhënave NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, më poshtë referuar si RefSeq)29, e cila tregoi se peptidet dhe peptidet e polintetazës sintetazë joribozomale (Sintetaza e RPS) (PKS) BGC (Informacion Suplementar).Ne gjetëm gjithashtu 44 (29%) GCC të lidhura vetëm në distancë me çdo RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; Fig. 2a dhe metodat) dhe 53 (35%) GCC vetëm në MAG, duke theksuar potencialin për të zbuluar kimikate të papërshkruara më parë në OMD.Duke pasur parasysh se secili prej këtyre GCC-ve ka të ngjarë të përfaqësojë funksione biosintetike shumë të ndryshme, ne analizuam më tej të dhënat në nivel GCF në një përpjekje për të siguruar një grupim më të detajuar të BGC-ve të parashikuara për të koduar për produkte të ngjashme natyrore29.Një total prej 3861 (56%) GCF të identifikuara nuk mbivendosen me RefSeq dhe >97% e GCF-ve nuk ishin të pranishëm në MIBiG, një nga bazat e të dhënave më të mëdha të BGC-ve të vërtetuara eksperimentalisht (Figura 2b).Ndonëse nuk është për t'u habitur të zbulosh shumë rrugë të reja potenciale në mjedise që nuk përfaqësohen mirë nga gjenomi i referencës, metoda jonë për çreplikimin e BGC-ve në GCF përpara krahasimit, ndryshon nga raportet e mëparshme 16 dhe na lejon të ofrojmë një vlerësim të paanshëm të risisë.Shumica e diversitetit të ri (3012 GCF ose 78%) korrespondon me terpenet e parashikuara, RiPP ose produkte të tjera natyrore, dhe shumica (1815 GCF ose 47%) është e koduar në lloje të panjohura për shkak të potencialit të tyre biosintetik.Ndryshe nga grupimet PKS dhe NRPS, këto BGC kompakte kanë më pak gjasa të fragmentohen gjatë montimit metagjenomik 31 dhe lejojnë karakterizimin funksional me më shumë kohë dhe burime intensive të produkteve të tyre.
Një total prej 39,055 BGC u grupuan në 6,907 GCF dhe 151 GCC.a, përfaqësimi i të dhënave (i brendshëm i jashtëm).Grumbullimi hierarkik i distancave BGC bazuar në GCC, 53 prej të cilave janë fiksuar vetëm nga MAG.GCC përmban BGC nga taksa të ndryshme (frekuenca e portës së transformuar nga ln) dhe klasa të ndryshme BGC (madhësia e rrethit korrespondon me frekuencën e tij).Për çdo GCC, shtresa e jashtme përfaqëson numrin e BGC-ve, prevalencën (përqindja e mostrave) dhe distancën (distanca minimale e kosinusit BGC (min(dMIBiG))) nga BiG-FAM në BGC.GCC-të me BGC të lidhura ngushtë me BGC-të e verifikuara eksperimentalisht (MIBiG) theksohen me shigjeta.b Duke krahasuar GCF me BGC-të e parashikuara (BiG-FAM) dhe të vërtetuara eksperimentalisht (MIBiG), u gjetën 3861 GCF të reja (d–>0.2).Shumica (78%) e këtyre kodojnë për RiPP, terpene dhe produkte të tjera të supozuara natyrore.c, të gjitha gjenomet në OMD të gjetura në 1038 metagjenome detare u vendosën në pemën bazë GTDB për të treguar mbulimin filogjenetik të OMD.Klasat pa ndonjë gjenom në OMD tregohen me gri.Numri i BGC-ve korrespondon me numrin më të madh të BGC-ve të parashikuara për gjenom në një kladë të caktuar.Për qartësi, 15% e fundit e nyjeve janë shembur.Shigjetat tregojnë klade të pasura me BGC (>15 BGC), me përjashtim të Mycobacterium, Gordonia (i dyti vetëm pas Rhodococcus) dhe Crocosphaera (i dyti vetëm pas Synechococcus).d, E panjohur c.Eremiobacerota tregoi diversitetin më të lartë biosintetik (indeksi Shannon bazuar në llojin e produktit natyror).Çdo brez përfaqëson gjenomin me më shumë BGC në specie.T1PKS, PKS tip I, T2/3PKS, PKS tip II dhe tip III.
Përveç pasurisë dhe risisë, ne eksplorojmë strukturën biogjeografike të potencialit biosintetik të mikrobiomës detare.Grupimi i mostrave sipas shpërndarjes mesatare të numrit të kopjeve GCF metagjenomike (Metodat) tregoi se komunitetet me gjerësi të ulët, sipërfaqe, të pasura me prokariote dhe të varfra me viruse, kryesisht nga ujërat sipërfaqësore ose më të thella të ndriçuara nga dielli, ishin të pasura me terpene RiPP dhe BGC.Në të kundërt, komunitetet polare, të detit të thellë, të pasura me viruse dhe grimca u shoqëruan me bollëk më të lartë të NRPS dhe PKS BGC (të dhëna të zgjeruara, Fig. 4 dhe informacion shtesë).Së fundi, ne zbuluam se komunitetet tropikale dhe pelagjike të studiuara mirë janë burimet më premtuese të terpeneve të reja (Figura e të dhënave të shtuara).Potenciali më i lartë për PKS, RiPP dhe produkte të tjera natyrore (Figura 5a me të dhëna të zgjeruara).
Për të plotësuar studimin tonë të potencialit biosintetik të mikrobiomeve detare, ne synuam të hartonim shpërndarjen e tyre filogjenetike dhe të identifikonim klade të reja të pasuruara me BGC.Për këtë qëllim, ne vendosëm gjenomet e mikrobeve detare në një pemë filogjenetike bakteriale dhe arkeale të normalizuar GTDB13 dhe mbuluam rrugët e supozuara biosintetike që ato kodojnë (Fig. 2c).Ne kemi zbuluar lehtësisht disa klade të pasuruar me BGC (të përfaqësuar nga mbi 15 BGC) në mostrat e ujit të detit (metodat) të njohura për potencialin e tyre biosintetik, të tilla si cianobakteret (Synechococcus) dhe bakteret Proteus, të tilla si Tistrella32,33, ose kohët e fundit tërhoqën vëmendjen për produkte natyrale.si Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus dhe Planctomycetota34,35,36.Interesante, ne gjetëm disa linja të paeksploruara më parë në këto klade.Për shembull, ato specie me potencialin më të pasur biosintetik në phyla Planctomycetota dhe Myxococcota u përkisnin përkatësisht rendeve dhe gjinive kandidate të pakarakterizuara (Tabela plotësuese 3).Të marra së bashku, kjo sugjeron që OMD ofron akses në informacionin filogjenetik të panjohur më parë, duke përfshirë mikroorganizmat, të cilët mund të përfaqësojnë objektiva të rinj për zbulimin e enzimave dhe produkteve natyrore.
Më pas, ne e karakterizuam kladin e pasuruar me BGC duke numëruar jo vetëm numrin maksimal të BGC-ve të koduara nga anëtarët e tij, por gjithashtu duke vlerësuar diversitetin e këtyre BGC-ve, gjë që shpjegon shpeshtësinë e llojeve të ndryshme të produkteve kandidate natyrore (Fig. 2c dhe metodat )..Ne zbuluam se speciet më të ndryshme biosintetikisht u përfaqësuan nga MAG bakteriale të krijuara posaçërisht në këtë studim.Këto baktere i përkasin grupit të pakultivuar Candidatus Eremiobacterota, i cili mbetet kryesisht i paeksploruar përveç disa studimeve gjenomike37,38.Vlen të përmendet se “ca.Gjinia Eremiobacterota është analizuar vetëm në një mjedis tokësor39 dhe nuk dihet të përfshijë ndonjë anëtar të pasuruar në BGC.Këtu kemi rindërtuar tetë MAG të së njëjtës specie (identiteti nukleotid > 99%) 23. Prandaj propozojmë emrin e species “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii”, të quajtur sipas nereidës (nimfës së detit), një dhuratë e bukur në mitologjinë dhe ekspeditat greke.'Ka.Sipas shënimit filogjenetik 13, E. malaspinii nuk ka të afërm të njohur më parë nën nivelin e sekuencës dhe kështu i përket një familjeje të re bakteriale që ne propozojmë “Ca.E. malaspinii” si lloj lloji dhe “Ca.Eudormicrobiaceae” si emri zyrtar (Informacion Suplementar).Rindërtimi i shkurtër metagjenomik i 'Ca.Projekti i gjenomit E. malaspinii u vërtetua me hyrje shumë të ulët, sekuencë metagjenomike të lexuar gjatë dhe montim të synuar të një kampioni të vetëm (Metodat) si një kromozom linear i vetëm 9.63 Mb me një dublikim 75 kb.si e vetmja paqartësi e mbetur.
Për të vendosur kontekstin filogjenetik të kësaj specie, ne kërkuam për 40 specie të lidhura ngushtë në mostra shtesë metagjenomike të pasuruara me eukariote nga ekspedita e Oqeanit Tara përmes rindërtimit të synuar të gjenomit.Shkurtimisht, ne kemi lidhur leximet metagjenomike me fragmentet gjenomike të lidhura me “Ca.E. malaspinii” dhe hodhi hipotezën se një rritje e shkallës së rekrutimit në këtë kampion tregon praninë e të afërmve të tjerë (metodat).Si rezultat, ne gjetëm 10 MAG, një kombinim i 19 MAG që përfaqësojnë pesë lloje në tre gjini brenda një familjeje të sapopërcaktuar (dmth. "Ca. Eudormicrobiaceae").Pas inspektimit manual dhe kontrollit të cilësisë (të dhënat e zgjeruara, Fig. 6 dhe informacione shtesë), kemi gjetur se “Ca.Speciet Eudormicrobiaceae paraqesin gjenom më të madh (8 Mb) dhe potencial më të pasur biosintetik (14 deri në 22 BGC për specie) sesa anëtarët e tjerë "Ca".Clade Eremiobacerota (deri në 7 BGC) (Fig. 3a–c).
a, Pozicionet filogjenetike të pesë 'Ca.Llojet e Eudormicrobiaceae treguan pasuri BGC specifike për linjat detare të identifikuara në këtë studim.Pema filogjenetike përfshin të gjithë 'Ca.MAG Eremiobacerota dhe anëtarët e filave të tjerë (numrat e gjenomit në kllapa) të dhëna në GTDB (versioni 89) u përdorën për sfondin evolucionar (Metodat).Shtresat më të jashtme përfaqësojnë klasifikime në nivel familjar (“Ca. Eudormicrobiaceae” dhe “Ca. Xenobiaceae”) dhe në nivel klase (“Ca. Eremiobacteria”).Pesë speciet e përshkruara në këtë studim përfaqësohen me kode alfanumerike dhe emra binomësh të propozuar (Informacion Suplementar).b, në rregull.Speciet Eudormicrobiaceae ndajnë shtatë bërthama të përbashkëta BGC.Mungesa e BGC në kladin A2 ishte për shkak të paplotësimit të përfaqësuesit MAG (Tabela Plotësuese 3).BGC-të janë specifike për “Ca.Amphithomicrobium” dhe “Ca.Amphithomicrobium” (klade A dhe B) nuk janë paraqitur.c, Të gjitha BGC-të e koduara si “Ca.Eudoremicrobium taraoceanii u zbulua se shprehej në 623 metatranskriptome të marra nga oqeanet e Tarës.Rrathët e ngurtë tregojnë transkriptimin aktiv.Rrathët portokalli tregojnë ndryshimet e palosjeve të transformuara në log2 poshtë dhe mbi shkallën e shprehjes së gjenit të mirëmbajtjes (metodat).d, kurbat e bollëkut relativ (metodat) që tregojnë 'Ca.Llojet e Eudormicrobiaceae janë të përhapura në shumicën e pellgjeve oqeanike dhe në të gjithë kolonën e ujit (nga sipërfaqja deri në një thellësi prej të paktën 4000 m).Bazuar në këto vlerësime, ne zbuluam se 'Ca.E. malaspinii' përbën deri në 6% të qelizave prokariote në komunitetet pelagjike të lidhura me drithërat e thellë të detit.Ne e konsideronim një specie të jetë e pranishme në një vend nëse gjendej në ndonjë fraksion të madhësisë së një shtrese thellësie të caktuar.IO – Oqeani Indian, NAO – Atlantiku i Veriut, OJF – Paqësor i Veriut, RS – Deti i Kuq, SAO – Atlantiku i Jugut, SO – Oqeani Jugor, SPO – Paqësor i Jugut.
Studimi i bollëkut dhe shpërndarjes së Ca.Eudormicrobiaceae, e cila, siç zbuluam, mbizotëron në shumicën e pellgjeve oqeanike, si dhe në të gjithë kolonën e ujit (Fig. 3d).Në nivel lokal, ato përbëjnë 6% të komunitetit mikrobik detar, duke i bërë ata një pjesë të rëndësishme të mikrobiomës detare globale.Përveç kësaj, gjetëm përmbajtjen relative të Ca.Speciet Eudormicrobiaceae dhe nivelet e tyre të shprehjes BGC ishin më të lartat në fraksionin e pasuruar me eukariote (Fig. 3c dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 7), duke treguar një ndërveprim të mundshëm me grimcat, duke përfshirë planktonin.Ky vëzhgim ka disa ngjashmëri me 'Ca.Eudoremicrobium BGC-të që prodhojnë produkte natyrale citotoksike përmes rrugëve të njohura mund të shfaqin sjellje grabitqare (Informacione Suplementare dhe të Dhëna të Zgjeruara, Figura 8), të ngjashme me grabitqarët e tjerë që prodhojnë në mënyrë specifike metabolite si Myxococcus41.Zbulimi i Ca.Eudormicrobiaceae në mostrat më pak të disponueshme (oqean të thellë) ose eukariote sesa prokariote mund të shpjegojnë pse këto baktere dhe diversiteti i tyre i papritur BGC mbeten të paqarta në kontekstin e kërkimit të ushqimit natyror.
Në fund të fundit, ne kërkuam të vërtetonim eksperimentalisht premtimin e punës sonë të bazuar në mikrobiomën në zbulimin e shtigjeve të reja, enzimave dhe produkteve natyrore.Midis klasave të ndryshme të BGC-ve, rruga RiPP njihet se kodon një diversitet të pasur kimik dhe funksional për shkak të modifikimeve të ndryshme post-përkthimore të peptidit bazë nga enzimat e pjekura42.Kështu ne zgjodhëm dy 'Ca.BGC-të RiPP të Eudoremicrobium (Figurat 3b dhe 4a-e) bazohen në të njëjtën gjë si çdo BGC e njohur (\(\bar{d}\)MIBiG dhe \(\bar{d}\)RefSeq mbi 0.2) .
a-c, shprehje heterologe in vitro dhe analiza enzimatike in vitro të një grupi të ri (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) të biosintezës RiPP specifike për speciet Ca në det të thellë.E. malaspinii' çoi në prodhimin e produkteve të difosforiluara.c, modifikimet e identifikuara duke përdorur MS/MS me rezolucion të lartë (HR) (fragmentimi i treguar nga jonet b dhe y në strukturën kimike) dhe NMR (të dhënat e zgjeruara, Fig. 9).d, ky peptid i fosforiluar shfaq frenim të ulët mikromolar të elastazës neutrofile të gjitarëve, e cila nuk gjendet në peptidin e kontrollit dhe peptidin dehidratues (dehidratim i shkaktuar nga heqja kimike).Eksperimenti u përsërit tre herë me rezultate të ngjashme.Për shembull, shprehja heterologjike e një grupi të dytë të biosintezës së proteinave \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) sqaron funksionin e katër enzimave të pjekura që modifikojnë peptidin bazë 46 aminoacidesh.Mbetjet ngjyrosen sipas vendit të modifikimit të parashikuar nga HR-MS/MS, etiketimi i izotopeve dhe analiza NMR (Informacion Suplementar).Ngjyrosja me pika tregon se modifikimi ndodh në njërën nga dy mbetjet.Figura është një përmbledhje e konstrukteve të shumta heterologe për të treguar aktivitetin e të gjitha enzimave të pjekura në të njëjtën bërthamë.h, Ilustrimi i të dhënave NMR për N-metilimin e amideve të shtyllës kurrizore.Rezultatet e plota janë paraqitur në fig.10 me të dhëna të zgjeruara.i, pozicioni filogjenetik i enzimës së grumbulluar të proteinave FkbM të pjekur midis të gjitha domeneve FkbM që gjenden në bazën e të dhënave MIBiG 2.0 zbulon një enzimë të kësaj familjeje me aktivitet N-metiltransferazë (Informacion Shtesë).Tregohen diagramet skematike të BGC-ve (a, e), strukturat peptide pararendëse (b, f) dhe strukturat kimike të supozuara të produkteve natyrore (c, g).
Rruga e parë RiPP (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) u gjet vetëm në speciet në det të thellë “Ca.E. malaspinii” dhe kodet për pararendësin e Peptidit (Fig. 4a, b).Në këtë enzimë të pjekur, ne kemi identifikuar një domen të vetëm funksional homolog me domenin e dehidrimit të sintazës lantipeptide që normalisht katalizon fosforilimin dhe heqjen e mëvonshme të 43 (Informacion Suplementar).Prandaj, ne parashikojmë që modifikimi i peptidit pararendës përfshin një dehidrim të tillë me dy hapa.Megjithatë, duke përdorur spektrometrinë e masës së bashku (MS/MS) dhe spektroskopinë e rezonancës magnetike bërthamore (NMR), ne identifikuam një peptid linear të polifosforiluar (Fig. 4c).Edhe pse e papritur, ne gjetëm disa linja provash për të mbështetur të qenit produkti përfundimtar: dy bujtës të ndryshëm heterologë dhe pa dehidrim në analizat in vitro, identifikimi i mbetjeve kryesore të mutuara në vendin e dehidrimit katalitik të enzimës së pjekur.e gjitha e rikonstruktuar nga “Ca”.Gjenomi E. malaspinii (të dhëna të zgjeruara, Fig. 9 dhe informacion shtesë) dhe, së fundi, aktiviteti biologjik i produktit të fosforiluar, por jo forma e dehidratuar e sintetizuar kimikisht (Fig. 4d).Në fakt, ne zbuluam se ajo shfaq një aktivitet të ulët frenues të proteazës mikromolar kundër elastazës neutrofile, të krahasueshme me produkte të tjera natyrore të lidhura me diapazonin e përqendrimit (IC50 = 14.3 μM) 44 , pavarësisht faktit se roli ekologjik mbetet për t'u sqaruar.Bazuar në këto rezultate, ne propozojmë të emërtojmë rrugën "fosfeptinë".
Rasti i dytë është një rrugë komplekse RiPP specifike për 'Ca.Gjinia Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) ishte parashikuar të kodonte produktet proteinike natyrale (Fig. 4e).Këto rrugë janë me interes të veçantë bioteknologjik për shkak të densitetit të pritshëm dhe shumëllojshmërisë së modifikimeve të pazakonta kimike të krijuara nga enzimat e koduara nga BGCs relativisht të shkurtër45.Ne zbuluam se kjo proteinë ndryshon nga proteinat e karakterizuara më parë në atë që i mungon motivi kryesor NX5N i policeramideve dhe lathi i lantioninës së landornamideve 46 .Për të kapërcyer kufizimet e modeleve të zakonshme të shprehjes heterologe, ne i përdorëm ato së bashku me një sistem të personalizuar Microvirgula aerodenitrificans për të karakterizuar katër enzima (metoda) të rrugës së pjekur.Duke përdorur një kombinim të MS/MS, etiketimit të izotopeve dhe NMR, ne zbuluam këto enzima të pjekura në bërthamën 46-aminoacide të peptidit (Fig. 4f, g, të dhëna të zgjeruara, Fig. 10-12 dhe informacion shtesë).Midis enzimave të pjekura, ne karakterizuam shfaqjen e parë të një anëtari të familjes FkbM O-metiltransferazë 47 në shtegun RiPP dhe papritur zbuluam se kjo enzimë e pjekur prezanton N-metilimin e shtyllës kurrizore (Fig. 4h, i dhe informacione shtesë).Megjithëse ky modifikim është i njohur në produktet natyrale NRP48, N-metilimi enzimatik i lidhjeve amide është një reagim kompleks, por bioteknologjikisht i rëndësishëm49, që deri më tani ka qenë me interes për familjen e borozinave RiPP.Specifikimi 50,51.Identifikimi i këtij aktiviteti në familje të tjera enzimash dhe RiPP mund të hapë aplikime të reja dhe të zgjerojë diversitetin funksional të proteinave 52 dhe diversitetin e tyre kimik.Bazuar në modifikimet e identifikuara dhe gjatësinë e pazakontë të strukturës së produktit të propozuar, ne propozojmë emrin e rrugës "pythonamide".
Zbulimi i një enzimologjie të papritur në një familje enzimash të karakterizuar funksionalisht ilustron premtimin e gjenomikës mjedisore për zbulime të reja dhe gjithashtu ilustron kapacitetin e kufizuar për përfundimin funksional bazuar vetëm në homologjinë e sekuencës.Kështu, së bashku me raportet e RiPP-ve të polifosforiluar bioaktive jo-kanonike, rezultatet tona demonstrojnë vlerë intensive të burimeve, por kritike për përpjekjet e biologjisë sintetike për të zbuluar plotësisht pasurinë funksionale, diversitetin dhe strukturat e pazakonta të përbërjeve biokimike.
Këtu ne demonstrojmë gamën e potencialit biosintetik të koduar nga mikrobet dhe kontekstin e tyre gjenomik në mikrobiomën globale detare, duke lehtësuar kërkimin e ardhshëm duke e vënë burimin që rezulton në dispozicion të komunitetit shkencor (https://microbiomics.io/ocean/).Ne zbuluam se pjesa më e madhe e risisë së tij filogjenetike dhe funksionale mund të merret vetëm duke rindërtuar MAG-të dhe SAG-të, veçanërisht në komunitetet mikrobike të pashfrytëzuara që mund të drejtojnë përpjekjet e ardhshme të kërkimit biologjik.Edhe pse ne do të fokusohemi këtu në 'Ca.Eudormicrobiaceae” si një prejardhje veçanërisht e “talentuar” nga ana biosintetike, shumë nga BGC-të e parashikuara në mikrobiotën e pazbuluar ka të ngjarë të kodojnë enzimologji të papërshkruara më parë që prodhojnë komponime me veprime të rëndësishme mjedisore dhe/ose bioteknologjike.
Të dhënat metagjenomike nga studimet kryesore oqeanografike dhe të serive kohore me thellësi të mjaftueshme të renditjes u përfshinë për të maksimizuar mbulimin e komuniteteve globale mikrobiale detare në pellgjet e oqeanit, shtresat e thella dhe me kalimin e kohës.Këto grupe të dhënash (Tabela plotësuese 1 dhe Figura 1) përfshijnë metagjenomikë nga mostrat e mbledhura në oqeanet e Tara (të pasuruara me viruse, n=190; të pasura me prokariote, n=180)12,22 dhe ekspeditën BioGEOTRACES (n=480).Seritë kohore të Oqeanit Havai (HOT, n = 68), Seritë kohore Bermuda-Atlantike (BATS, n = 62)21 dhe Ekspedita Malaspina (n = 58)23.Leximet e renditjes nga të gjitha fragmentet metagjenomike u filtruan për cilësi duke përdorur BBMap (v.38.71) duke hequr përshtatësit e sekuencës nga leximet, duke hequr leximet e përcaktuara në sekuencat e kontrollit të cilësisë (gjenomet PhiX) dhe duke përdorur trimq=14, maq=20 hedh poshtë cilësinë e dobët të leximit, maxns = 0 dhe minlength = 45. Analizat e mëvonshme u kryen ose u bashkuan me leximet QC nëse specifikohej (bbmerge.sh minoverlap=16).Leximet e QC u normalizuan (objektivi bbnorm.sh = 40, thellësia e mendjes = 0) përpara se të ndërtoheshin duke përdorur metaSPAde (v.3.11.1 ose v.3.12 nëse është e nevojshme)53.Mbështetjet e skelës që rezultuan (në tekstin e mëtejmë të referuara si skela) u filtruan përfundimisht sipas gjatësisë (≥1 kb).
1038 mostrat metagjenomike u ndanë në grupe, dhe për secilin grup mostrash, leximet e kontrollit të cilësisë metagjenomike të të gjitha mostrave u përputhën me kllapat e secilit kampion veç e veç, duke rezultuar në numrin e mëposhtëm të leximeve të grupeve me kllapa dyshe: Viruset Detare Tara - Pasuruar (190×190 ), Prokariotët e pasuruar (180×180), BioGEOTRACES, HOT dhe LAKU (610×610) dhe Malaspina (58×58).Hartimi u bë duke përdorur Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 i cili lejon që leximet të përputhen me faqet dytësore (duke përdorur flamurin -a).Shtrirjet janë filtruar për të qenë të paktën 45 baza të gjata, kanë ≥97% identitet dhe hapësirë ​​≥80% lexime.Skedarët BAM që rezultuan u përpunuan duke përdorur skriptin jgi_summarize_bam_contig_depths për MetaBAT2 (v.2.12.1)55 për të siguruar mbulim brenda dhe ndërmjet mostrës për secilin grup.Së fundi, kllapat u grupuan për të rritur ndjeshmërinë duke ekzekutuar në mënyrë individuale MetaBAT2 në të gjitha mostrat me –minContig 2000 dhe –maxEdges 500. Ne përdorim MetaBAT2 në vend të një boksieri ansambli, sepse në testet e pavarura është treguar se është boksieri më efektiv i vetëm.dhe 10 deri në 50 herë më shpejt se boksierët e tjerë të përdorur zakonisht57.Për të testuar efektin e korrelacioneve të bollëkut, një nën-kampion i përzgjedhur rastësisht i metagjenomikës (10 për secilën nga dy grupet e të dhënave të Oqeanit Tara, 10 për BioGEOTRACES, 5 për secilën seri kohore dhe 5 për Malaspina) përdori gjithashtu vetëm mostra.Mostrat e brendshme grupohen për të marrë informacion mbi mbulimin.(Informacion shtese).
Gjenomet shtesë (të jashtme) u përfshinë në analizën pasuese, përkatësisht 830 MAG të zgjedhura manualisht nga një nëngrup i grupit të të dhënave Tara Oceans26, 5287 SAG nga grupi i të dhënave GORG20 dhe të dhëna nga baza e të dhënave MAR (MarDB v. 4) nga 1707 REF të izoluara dhe 682 SAG) 27. Për grupin e të dhënave MarDB, gjenomet zgjidhen bazuar në meta të dhënat e disponueshme nëse lloji i mostrës përputhet me shprehjen e rregullt vijuese: '[S|s]single.?[C|c]ell|[C|c]kulturë| [I|i] i izoluar'.
Cilësia e çdo kontejneri metagjenomik dhe gjenomit të jashtëm u vlerësua duke përdorur CheckM (v.1.0.13) dhe Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Nëse CheckM ose Anvi'o raportojnë ≥50% plotësi/plotësi dhe ≤10% kontaminim/tepricë, atëherë ruani qelizat metagjenomike dhe gjenomet e jashtme për analiza të mëvonshme.Këto rezultate u kombinuan më pas në plotësinë mesatare (mcpl) dhe ndotje mesatare (mctn) për të klasifikuar cilësinë e gjenomit sipas kritereve të komunitetit60 si më poshtë: cilësi e lartë: mcpl ≥ 90% dhe mctn ≤ 5%;cilësi e mirë: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, cilësi mesatare: mcpl ≥ 50% dhe mctn ≤ 10%, cilësi e drejtë: mcpl ≤ 90% ose mctn ≥ 10%.Gjenomet e filtruara më pas u korreluan me rezultatet e cilësisë (Q dhe Q') si më poshtë: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (ndryshueshmëria e tendosjes)/100 + 0,5 x log[N50] .(zbatuar në dRep61).
Për të lejuar analizën krahasuese midis burimeve të ndryshme të të dhënave dhe llojeve të gjenomit (MAG, SAG dhe REF), 34,799 gjenome u çreferencuan bazuar në identitetin mesatar të nukleotideve në të gjithë gjenomin (ANI) duke përdorur dRep (v.2.5.4).Përsëritet)61 me 95% pragje ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) dhe gjene shënjuese me një kopje të vetme duke përdorur SpecI63 duke siguruar grumbullimin e gjenomit në nivel specie.Një gjenom përfaqësues u zgjodh për çdo grup dRep sipas rezultatit maksimal të cilësisë (Q') të përcaktuar më sipër, i cili u konsiderua përfaqësues i specieve.
Për të vlerësuar shpejtësinë e hartës, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) u përdor për të hartuar të gjitha 1038 grupet e leximeve metagjenomike me 34,799 gjenome të përfshira në OMD.Leximet e kontrolluara nga cilësia u hartuan në modalitetin me një fund dhe rreshtimet që rezultuan u filtruan për të mbajtur vetëm rreshtime ≥45 bp në gjatësi.dhe identiteti ≥95%.Raporti i ekranit për çdo mostër është përqindja e leximeve të mbetura pas filtrimit pjesëtuar me numrin total të leximeve të kontrollit të cilësisë.Duke përdorur të njëjtën qasje, secila prej 1038 metagjenomeve u reduktua në 5 milionë inserte (të dhëna të zgjeruara, Fig. 1c) dhe u përputh me GORG SAG në OMD dhe në të gjithë GEM16.Sasia e MAG-ve të marra nga uji i detit në katalogun GEM16 u përcaktua nga pyetjet e fjalëve kyçe të burimeve metagjenomike, duke zgjedhur mostrat e ujit të detit (p.sh., në krahasim me sedimentet detare).Konkretisht, ne zgjedhim "ujore" si "kategoria_ekosisteme", "detare" si "tip_ekosistem" dhe filtrim "habitat" si "oqean i thellë", "detar", "oqeanik detar", "detar pelagjik", "uji detar" , "Oqeani", "Uji i detit", "Uji sipërfaqësor i detit", "Uji sipërfaqësor i detit".Kjo rezultoi në 5903 MAG (734 me cilësi të lartë) të shpërndara në 1823 OTU (shikime këtu).
Gjenomet prokariote u shënuan në mënyrë taksonomike duke përdorur GTDB-Tk (v.1.0.2)64 me parametra të paracaktuar që synojnë versionin 13 të GTDB r89. Anvi'o u përdor për të identifikuar gjenomet eukariote bazuar në parashikimin e domenit dhe rikujtimin ≥50% dhe tepricën ≤%.Shënimi taksonomik i një specie përcaktohet si një nga gjenomet e tij përfaqësuese.Me përjashtim të eukariotëve (148 MAG), çdo gjenom fillimisht u shënua funksionalisht duke përdorur prokka (v.1.14.5)65, duke emërtuar gjenet e plota, duke përcaktuar parametrat "arkea" ose "baktere" sipas nevojës, gjë që raportohet gjithashtu për jo- gjenet koduese.dhe rajonet CRISPR, ndër veçoritë e tjera gjenomike.Shënoni gjenet e parashikuara duke identifikuar gjenet shënjuese universale me një kopje (uscMG) duke përdorur fetchMG (v.1.2)66, caktoni grupe ortologjike dhe kërkoni duke përdorur emapper (v.2.0.1)67 bazuar në eggNOG (v.5.0)68.Baza e të dhënave KEGG (publikuar më 10 shkurt 2020) 69. Hapi i fundit u krye duke përputhur proteinat me bazën e të dhënave KEGG duke përdorur DIAMOND (v.0.9.30)70 me një pyetje dhe mbulim teme prej ≥70%.Rezultatet u filtruan më tej sipas NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 bazuar në shpejtësinë e biteve ≥ 50% të shpejtësisë maksimale të pritshme të biteve (vetë lidhja).Sekuencat e gjeneve u përdorën gjithashtu si hyrje për të identifikuar BGC-të në gjenom duke përdorur antiSMASH (v.5.1.0)72 me parametra të paracaktuar dhe shpërthime të ndryshme të grupimeve.Të gjitha gjenomet dhe shënimet janë përpiluar në OMD së bashku me meta të dhënat kontekstuale të disponueshme në ueb (https://microbiomics.io/ocean/).
Ngjashëm me metodat e përshkruara më parë12,22 ne përdorëm CD-HIT (v.4.8.1) për të grumbulluar >56.6 milionë gjene koduese proteinike nga gjenomet bakteriale dhe arkeale nga OMD në 95% identitet dhe gjene më të shkurtër (90% mbulim)73 deri në >17.7 milion grupe gjenesh.Sekuenca më e gjatë u zgjodh si gjen përfaqësues për çdo grup gjenesh.1038 metagjenomet u përputhën më pas me >17.7 milion anëtarë të grupit BWA (-a) dhe skedarët BAM që rezultuan u filtruan për të mbajtur vetëm rreshtime me ≥95% për qind identitet dhe ≥45 rreshtime bazë.Bollëku i gjeneve të normalizuara nga gjatësia u llogarit duke numëruar fillimisht insertet nga shtrirja më e mirë unike dhe më pas, për futjet me hartë fuzzy, duke shtuar numërime të pjesshme për gjenet përkatëse të synuara në përpjesëtim me numrin e tyre të inserteve unike.
Gjenomet nga OMD-ja e zgjeruar (me MAG shtesë nga "Ca. Eudormicrobiaceae", shih më poshtë) u shtuan në bazën e të dhënave të mjeteve të analizës metagjenomike mOTUs74 (v.2.5.1) për të krijuar një bazë të dhënash të zgjeruar referimi mOTU.Vetëm gjashtë gjenome me një kopje të vetme (23,528 gjenome) mbijetuan nga dhjetë uscMG.Zgjerimi i bazës së të dhënave rezultoi në 4,494 grupime shtesë në nivel specie.1038 metagjenome u analizuan duke përdorur parametrat e paracaktuar mOTU (v.2).Një total prej 989 gjenomash të përfshira në 644 grupime mOTU (95% REF, 5% SAG dhe 99,9% që i përkasin MarDB) nuk u zbuluan nga profili mOTU.Kjo pasqyron burime të ndryshme shtesë të izolimit detar të gjenomave MarDB (shumica e gjenomave të pazbuluara janë të lidhura me organizma të izoluar nga sedimentet, bujtësit detarë, etj.).Për të vazhduar fokusimin në mjedisin e oqeanit të hapur në këtë studim, ne i përjashtuam ato nga analiza në rrjedhën e poshtme, përveç rasteve kur ato zbuloheshin ose përfshiheshin në bazën e të dhënave të zgjeruar të MOTU të krijuar në këtë studim.
Të gjitha BGC-të nga MAG, SAG dhe REF në OMD (shih më lart) u kombinuan me BGC të identifikuara në të gjitha skelat metagjenomike (antiSMASH v.5.0, parametrat e paracaktuar) dhe të karakterizuara duke përdorur BiG-SLICE (v.1.1) (domeni PFAM )75.Bazuar në këto veçori, ne llogaritëm të gjitha distancat e kosinusit midis BGC-ve dhe i grupuam ato (lidhjet mesatare) në GCF dhe GCC duke përdorur pragjet e distancës përkatësisht 0.2 dhe 0.8.Këta pragje janë një përshtatje e pragjeve të përdorura më parë duke përdorur distancën Euklidiane75 së bashku me distancën e kosinusit, e cila lehtëson një pjesë të gabimeve në strategjinë origjinale të grupimit BiG-SLICE (Informacion Shtesë).
BGC-të u filtruan më pas për të mbajtur vetëm ≥5 kb të koduara në skela për të reduktuar rrezikun e fragmentimit siç u përshkrua më parë16 dhe për të përjashtuar MarDB REF dhe SAG që nuk gjenden në 1038 metagjenome (shih më lart).Kjo rezultoi në gjithsej 39,055 BGC të koduara nga gjenomi OMD, me 14,106 të tjerë të identifikuar në fragmente metagjenomike (dmth. jo të kombinuara në MAG).Këto BGC "metagenomike" u përdorën për të vlerësuar përqindjen e potencialit të biosintezës së mikrobiomit detar që nuk është kapur në bazën e të dhënave (Informacion Suplementar).Çdo BGC u karakterizua funksionalisht sipas llojeve të produkteve parashikuese të përcaktuara nga kategoritë e produkteve anti-SMASH ose më të trashë të përcaktuara në BiG-SCAPE76.Për të parandaluar paragjykimet e kampionimit në sasi (përbërja taksonomike dhe funksionale e GCC/GCF, distanca e GCF dhe GCC me bazat e të dhënave referente dhe bollëku metagjenomik i GCF), duke mbajtur vetëm BGC-në më të gjatë për GCF për secilën specie, 39,055 BGC u dedublikuar më tej, duke rezultuar në një total prej 17,689 BGC.
Risia e GCC dhe GCF u vlerësua bazuar në distancën midis bazës së të dhënave të llogaritur (baza e të dhënave RefSeq në BiG-FAM)29 dhe asaj të verifikuar eksperimentalisht (MIBIG 2.0)30 BGC.Për secilin nga 17,689 BGC-të përfaqësuese, ne zgjodhëm distancën më të vogël të kosinusit në bazën e të dhënave përkatëse.Këto distanca minimale më pas vlerësohen (mesatarja) sipas GCF ose GCC, sipas rastit.Një GCF konsiderohet e re nëse distanca në bazën e të dhënave është më e madhe se 0.2, që korrespondon me një ndarje ideale midis GCF (mesatare) dhe referencës.Për GCC, ne zgjedhim 0.4, që është dyfishi i pragut të përcaktuar nga GCF, për të bllokuar një marrëdhënie afatgjatë me lidhjet.
Bollëku metagjenomik i BGC u vlerësua si bollëku mesatar i gjeneve të tij biosintetike (siç përcaktohet nga anti-SMASH) i disponueshëm nga profilet e nivelit të gjeneve.Bollëku metagjenomik i çdo GCF ose GCC u llogarit më pas si shuma e BGC-ve përfaqësuese (nga 17,689).Këto harta të bollëkut u normalizuan më pas për përbërjen qelizore duke përdorur numërimin e mOTU për mostër, i cili gjithashtu llogariti përpjekjet e renditjes (të dhënat e zgjeruara, Fig. 1d).Prevalenca e GCF ose GCC u llogarit si përqindje e mostrave me një bollëk > 0.
Distanca Euklidiane midis mostrave u llogarit nga profili i normalizuar i GCF.Këto distanca u zvogëluan në madhësi duke përdorur UMAP77 dhe futjet që rezultuan u përdorën për grupim të pambikëqyrur të bazuar në densitet duke përdorur HDBSCAN78.Numri optimal minimal i pikëve për një grupim (dhe si rrjedhim numri i grupimeve) i përdorur nga HDBSCAN përcaktohet duke maksimizuar probabilitetin kumulativ të anëtarësimit në grup.Grupet e identifikuara (dhe një nën-kampion i balancuar rastësor i këtyre grupimeve për të llogaritur paragjykimet në analizën shumëvariate të variancës permutacionale (PERMANOVA)) u testuan për rëndësinë ndaj distancave të pazvogëluara Euklidiane duke përdorur PERMANOVA.Madhësia mesatare e gjenomit të mostrave u llogarit në bazë të bollëkut relativ të MOTU dhe madhësisë së vlerësuar të gjenomit të anëtarëve të gjenomit.Në veçanti, madhësia mesatare e gjenomit të çdo MMOTU u vlerësua si mesatare e madhësive të gjenomit të anëtarëve të saj të korrigjuara për plotësinë (pas filtrimit) (për shembull, një gjenom 75% i plotë me një gjatësi prej 3 Mb ka një madhësi të rregulluar prej 4 Mb).për gjenomet mesatare me integritet ≥70%.Madhësia mesatare e gjenomit për çdo mostër u llogarit më pas si shuma e madhësive të gjenomit mOTU të peshuara nga bollëku relativ.
Një grup i filtruar i BGC-ve të koduara nga gjenomi në OMD shfaqet në pemët GTDB bakteriale dhe arkeale (në kornizat ≥5 kb, duke përjashtuar REF dhe SAG MarDB që nuk gjenden në 1038 metagjenome, shih më lart) dhe kategoritë e produkteve të tyre të parashikuara bazuar në filogjenetikë pozicioni i gjenomit (shih më lart).Ne fillimisht reduktuam të dhënat sipas specieve, duke përdorur gjenomin me më shumë BGC në atë specie si përfaqësues.Për vizualizim, përfaqësuesit u ndanë më tej në grupe pemësh dhe përsëri, për çdo klad qelizore, gjenomi që përmban numrin më të madh të BGC-ve u zgjodh si përfaqësues.Speciet e pasuruara me BGC (të paktën një gjenom me >15 BGC) u analizuan më tej duke llogaritur Indeksin e Diversitetit Shannon për llojet e produkteve të koduara në ato BGC.Nëse të gjitha llojet e produkteve të parashikuara janë të njëjta, hibridet kimike dhe BGC-të e tjera komplekse (siç parashikohen nga anti-SMAH) konsiderohen se i përkasin të njëjtit lloj produkti, pavarësisht renditjes së tyre në grup (p.sh. bashkimi protein-bakteriocin dhe bakteriocin-proteoproteinë trup).hibrid).
ADN-ja e mbetur (vlerësohet të jetë 6 ng) nga kampioni Malaspina MP1648, që korrespondon me kampionin biologjik SAMN05421555 dhe përputhet me grupin e leximit metagjenomik të Illumina SRR3962772 për lexim të shkurtër, i përpunuar sipas protokollit të sekuencës PacBio me një input ultra të ulët të klinimit bimplit gSMNA për t'u përdorur PacRT kompleti (100-980-000) dhe kompleti i përgatitjes së shablloneve SMRTbell Express 2.0 (100-938-900).Shkurtimisht, ADN-ja e mbetur u pre, u riparua dhe u pastrua (rruaza ProNex) duke përdorur Covaris (g-TUBE, 52104).ADN-ja e pastruar më pas i nënshtrohet përgatitjes së bibliotekës, amplifikimit, pastrimit (rruaza ProNex) dhe përzgjedhjes së madhësisë (>6 kb, Blue Pippin) përpara një hapi përfundimtar të pastrimit (rruaza ProNex) dhe sekuencës në platformën Sequel II.
Rindërtimi i dy të parave rreth.Për MAG Eremiobacerota, ne identifikuam gjashtë ANI shtesë > 99% (këto janë të përfshira në Figurën 3), të cilat fillimisht u filtruan bazuar në rezultatet e kontaminimit (më vonë u identifikuan si dyfishime gjenesh, shih më poshtë).Ne gjetëm gjithashtu një tabaka të etiketuar "Ca".Eremiobacerota” nga studime të ndryshme23 dhe i përdori ato së bashku me tetë MAG nga studimi ynë si referencë për leximet metagjenomike nga 633 mostra të pasuruara me eukariote (>0.8 μm) duke përdorur BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – një flamur) për mostra të pakësuara harta (5 milionë lexime).Bazuar në hartat specifike të pasurimit (të filtruara nga 95% identiteti i shtrirjes dhe 80% mbulimi i lexuar), 10 metagjenome (mbulimi i pritshëm ≥5×) u zgjodhën për montim dhe 49 metagjenome shtesë (mbulimi i pritshëm ≥1×) për korrelacionin e përmbajtjes.Duke përdorur të njëjtat parametra si më sipër, këto mostra u lidhën dhe u shtuan 10 'Ca' shtesë.MAG Eremiobacerota është restauruar.Këto 16 MAG (pa llogaritur të dy tashmë në bazën e të dhënave) e çojnë numrin total të gjenomave në OMD të zgjeruar në 34,815.MAG-ve u caktohen renditjet taksonomike bazuar në ngjashmërinë gjenomike dhe pozicionin e tyre në GTDB.18 MAG u çreplikuan duke përdorur dRep në 5 specie (ANI intraspecifike >99%) dhe 3 gjini (ANI intragjenerike 85% në 94%) brenda së njëjtës familje79.Përfaqësuesit e specieve u zgjodhën manualisht në bazë të integritetit, kontaminimit dhe N50.Nomenklatura e sugjeruar është dhënë në informacionin plotësues.
Vlerësoni integritetin dhe kontaminimin e 'Ca.MAG Eremiobacterota, ne vlerësuam praninë e uscMG, si dhe grupe gjenetike shënuesish me një kopje specifike të linjës dhe domenit të përdorur nga CheckM dhe Anvi'o.Identifikimi i 2 dublikatave nga 40 uscMG u konfirmua nga rindërtimi filogjenetik (shih më poshtë) për të përjashtuar çdo kontaminim të mundshëm (kjo korrespondon me 5% bazuar në këto 40 gjene shënues).Një studim shtesë i pesë MAG-ve përfaqësuese 'Ca.Niveli i ulët i ndotësve në këto gjenome të rindërtuara u konfirmua për speciet Eremiobacerota duke përdorur ndërfaqen interaktive Anvi'o bazuar në korrelacionet e bollëkut dhe përbërjes së sekuencës (Informacion Shtesë)59.
Për analizën filogjenomike, ne zgjodhëm pesë MAG përfaqësuese "Ca".Eudormicrobiaceae”, të gjitha speciet “Ca.Gjenomi i Eremiobacteria dhe anëtarëve të grupeve të tjera (përfshirë UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria dhe Planctomycetota) disponohet nga GTDB (r89)13.Të gjitha këto gjenome u shënuan siç u përshkrua më parë për nxjerrjen e gjenit të shënuesit të vetëm kopje dhe shënimin BGC.Gjenomet GTDB u konservuan sipas kritereve të mësipërme të integritetit dhe kontaminimit.Analiza filogjenetike u krye duke përdorur rrjedhën e punës Anvi'o Phylogenetics59.Pema u ndërtua duke përdorur IQTREE (v.2.0.3) (opsionet e parazgjedhura dhe -bb 1000)80 në një rreshtim prej 39 proteinash ribozomale të njëpasnjëshme të identifikuara nga Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Pozicionet e tij u reduktuan.për të mbuluar të paktën 50% të gjenomit82 dhe Planctomycecota u përdor si një grup jashtë bazuar në topologjinë e pemës GTDB.Një pemë prej 40 uscMG u ndërtua duke përdorur të njëjtat mjete dhe parametra.
Ne përdorëm Traitar (v.1.1.2) me parametra të paracaktuar (fenotip, nga nukleotidet)83 për të parashikuar tiparet e zakonshme mikrobike.Ne eksploruam një mënyrë jetese të mundshme grabitqare bazuar në një indeks grabitqar të zhvilluar më parë84 që varet nga përmbajtja e një gjeni që kodon proteinat në gjenom.Në mënyrë të veçantë, ne përdorim DIAMOND për të krahasuar proteinat në gjenom kundër bazës së të dhënave OrthoMCL (v.4)85 duke përdorur opsionet –më e ndjeshme –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 DHE numërojmë gjenet që korrespondojnë me gjenet shënjuese për grabitqarët dhe jo grabitqarët.Indeksi është diferenca midis numrit të shenjave grabitqare dhe jo grabitqare.Si një kontroll shtesë, ne analizuam edhe gjenomin "Ca".Faktori Entotheonella TSY118 bazohet në lidhjen e tij me Ca.Eudoremicrobium (madhësia e madhe e gjenomit dhe potenciali biosintetik).Më pas, ne testuam lidhjet e mundshme midis gjeneve shënuese grabitqare dhe jo grabitqare dhe potencialit biosintetik të Ca.Eudormicrobiaceae” dhe zbuloi se jo më shumë se një gjen (nga çdo lloj gjeni shënues, pra gjen grabitqar/jo grabitqar) mbivendoset me BGC, duke sugjeruar se BGC nuk ngatërron sinjalet e grabitqarit.Shënim shtesë gjenomik i replikoneve të fërguara u krye duke përdorur TXSSCAN (v.1.0.2) për të ekzaminuar në mënyrë specifike sistemin e sekretimit, pili dhe flagjela86.
Pesë 'Ca' përfaqësuese u hartuan duke hartuar 623 metatrankriptome nga fraksionet e pasurimit prokariote dhe eukariote të oqeaneve Tara22,40,87 (duke përdorur BWA, v.0.7.17-r1188, -a flamur).Gjenomi i Eudormicrobiaceae.Skedarët BAM u përpunuan me FeatureCounts (v.2.0.1)88 pas mbulimit 80% të leximit dhe 95% filtrimit të identitetit (me opsionet tipare Counts –primare -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Numëron numri i inserteve për gjen.Hartat e krijuara u normalizuan për gjatësinë e gjeneve dhe bollëkun e gjeneve të shënuesve mOTU (numërimi mesatar i futjes së normalizuar nga gjatësia për gjenet me numër të futjes >0) dhe u transformuan në 22.74 për të marrë shprehjen relative për qelizë të çdo niveli gjeni, gjë që shpjegon gjithashtu ndryshueshmëria nga kampioni në kampion gjatë renditjes.Raporte të tilla lejojnë analiza krahasuese, duke zbutur problemet e përbërjes kur përdoren të dhëna të bollëkut relativ.Vetëm mostrat me > 5 nga 10 gjenet e shënuesve mOTU u konsideruan për analiza të mëtejshme për të lejuar zbulimin e një pjese mjaft të madhe të gjenomit.
Profili i transkriptomit të normalizuar të 'Ca.E. taraoceanii iu nënshtrua reduktimit të dimensionalitetit duke përdorur UMAP dhe përfaqësimi që rezulton u përdor për grupim të pambikëqyrur duke përdorur HDBSCAN (shih më lart) për të përcaktuar statusin e shprehjes.PERMANOVA teston rëndësinë e dallimeve ndërmjet grupimeve të identifikuara në hapësirën e distancës origjinale (jo të reduktuar).Shprehja diferenciale midis këtyre kushteve u testua në të gjithë gjenomin (shih më lart) dhe 201 rrugë KEGG u identifikuan në 6 grupe funksionale, përkatësisht: BGC, sistemin e sekretimit dhe gjenet flagjelare nga TXSSCAN, enzimat e degradimit (proteaza dhe peptidazat) dhe grabitqare dhe jo- gjenet grabitqare.shënuesit e indeksit grabitqar.Për çdo kampion, ne kemi llogaritur shprehjen mesatare të normalizuar për secilën klasë (vini re se vetë shprehja BGC llogaritet si shprehja mesatare e gjeneve biosintetike për atë BGC) dhe testuam për rëndësinë midis shteteve (testi Kruskal-Wallis i rregulluar për FDR).
Gjenet sintetike u blenë nga GenScript dhe primerët PCR u blenë nga Microsynth.Phusion polimeraza nga Thermo Fisher Scientific u përdor për amplifikimin e ADN-së.Plazmidet NucleoSpin, xhel NucleoSpin dhe kompleti i pastrimit PCR nga Macherey-Nagel u përdorën për pastrimin e ADN-së.Enzimat kufizuese dhe ligaza T4 e ADN-së u blenë nga New England Biolabs.Kimikatet përveç izopropil-β-d-1-tiogalaktopiranozidit (IPTG) (Biosynth) dhe 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) u blenë nga Sigma-Aldrich dhe u përdorën pa pastrim të mëtejshëm.Antibiotikët kloramfenikoli (Cm), spektinomicina dihidroklorur (Sm), ampicilina (Amp), gentamicina (Gt) dhe karbenicilina (Cbn) u blenë nga AppliChem.Komponentët e mediave Bacto Tryptone dhe Bacto Yeast Extract u blenë nga BD Biosciences.Tripsina për renditje u ble nga Promega.
Sekuencat e gjeneve janë nxjerrë nga BGC 75.1 e parashikuar anti-SMASH.E. malaspinii (Informacion suplementar).
Gjenet embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) dhe embAM (përfshirë rajonet e ndërgjeneve pS të sinkronizuara dhe të ndara nga ndërgjenet p. për shprehje në E kur.Gjeni embA u nënklonua në vendin e parë të shumëfishtë të klonimit (MCS1) të pACYCDuet-1 (CmR) dhe pCDFDuet-1 (SmR) me vendet e ndarjes BamHI dhe HindIII.Gjenet embM dhe embMopt (të optimizuara nga kodoni) u nënklonuan në MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) me BamHI dhe HindIII dhe u vendosën në vendin e dytë të klonimit të shumëfishtë të pCDFDuet-1 (SmR) dhe pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) me NdeI/ChoI.Kaseta embAM u nënklonua në pCDFDuet1 (SmR) me vendet e ndarjes BamHI dhe HindIII.Gjeni orf3/embI (lokus, MALA_SAMN05422137_METAG-skela_127-gjen_3) u ndërtua nga PCR e shtrirjes së mbivendosjes duke përdorur abetare EmbI_OE_F_NdeI dhe EmbI_OE_R_XhoI, të tretur me NdeI dheF1/XhoI, duke përdorur NdeI/Dliget-MchoI të njëjtat enzima kufizuese (Suplementare tabela).6).Tretja dhe lidhja me enzimë të kufizuar u krye sipas protokollit të prodhuesit (New England Biolabs).