310 Komponent kimik i tubit të mbështjellë prej çeliku inox 10*1 mm, Domenet N-terminale të spidroinës formojnë hidrogele të bazuara në fibrilet amiloidale dhe ofrojnë një platformë për imobilizimin e proteinave.

Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Rrëshqitës që tregojnë tre artikuj për rrëshqitje.Përdorni butonat e pasëm dhe të ardhshëm për të lëvizur nëpër rrëshqitje, ose butonat e kontrolluesit të rrëshqitjes në fund për të lëvizur nëpër secilën rrëshqitje.

Specifikim

310 Furnizuesit e tubave me mbështjellje 10*1mm inox

Përbërje kimike

Vetitë mekanike

Proteinat e mëndafshit të merimangës rekombinante (proteinat e mëndafshit të merimangës) kanë shumë aplikime të mundshme në zhvillimin e biomaterialeve të reja, por natyra e tyre multimodale dhe e prirur ndaj grumbullimit i bën ato të vështira për t'u marrë dhe të lehtë për t'u përdorur.Këtu raportojmë se proteinat miniaturë spidroin rekombinante dhe, më e rëndësishmja, vetë domeni N-terminal (NT) formojnë me shpejtësi hidrogele vetë-mbështetëse dhe transparente në 37 °C.Proteinat e shkrirjes që përbëhen nga NT dhe proteina fluoreshente jeshile ose fosforilaza nukleozide purine formojnë proteina të fuzionit plotësisht funksionale.Hidrogelet.Rezultatet tona tregojnë se proteinat rekombinante NT dhe të shkrirjes ofrojnë rendimente të larta të shprehjes dhe u japin hidrogeleve veti tërheqëse si transparenca, xhelatimi pa lidhje të kryqëzuara dhe imobilizimi i drejtpërdrejtë i proteinave aktive me densitet të lartë.
Merimangat kanë deri në shtatë grupe të ndryshme gjëndrash mëndafshi, secila prej të cilave prodhon një lloj të veçantë mëndafshi.Të shtatë llojet e mëndafshit përbëhen nga proteinat e mëndafshit të merimangës (spidroins) me gjatësi rreth 6000 mbetje dhe përmbajnë një rajon të madh të përsëritjes qendrore të rrethuar nga domenet sferike N- dhe C-terminale (NT dhe CT)1,2.Lloji më i studiuar i mëndafshit, ampula primare, prodhohet nga gjëndra primare e ampulës.Në këtë gjëndër, një shtresë e vetme e qelizave epiteliale sintetizon proteinat spidroin dhe i sekreton ato në lumenin e gjëndrës, ku ato janë të pranishme në një formë të tretshme (doping) në përqendrime jashtëzakonisht të larta (30-50% w/v)3,4.Organizimi dhe konformimi i proteinave kryesore të spidroinës ampullare në gjëndër është debatuar, por shumica e provave eksperimentale tregojnë praninë e një konformacioni spirale përgjithësisht dhe/ose të rastësishëm dhe strukturave micelare ose lamelare5,6,7,8,9,10.Ndërsa domenet përsëritëse rregullojnë vetitë mekanike të fibrave të mëndafshit, duke formuar nanokristale me fletë β dhe struktura amorfe11,12,13,14,15, domenet fundore rregullojnë fibrat e mëndafshit në përgjigje të kushteve të ndryshimit përgjatë gjëndrës së mëndafshit16,17,18.Duke kontrolluar formimin e mëndafshit, 19. Domenet terminale ruhen në mënyrë evolucionare dhe funksioni i tyre mund të jetë i përbashkët për të gjitha proteinat spidroin 2,20,21.Gjatë kalimit nëpër gjëndër, pH e spidroinës zvogëlohet nga rreth 7,6 në < 5,716 dhe rritet me prerjen dhe shtrirjen e ndërmjetësuar nga lëvizja nëpër kanalin që ngushtohet gradualisht.Në tretësirë, CT është një dimer paralel konstituiv α-spiral17, por në përgjigje të pH-së së ulët dhe forcave të prerjes, CT shpaloset dhe ndërron shtresat β16, 17, ndoshta duke shkaktuar shtresa β në rajonet përsëritëse të "Convert 16". NT janë monomere nën kushtet që pasqyrojnë kushtet në lumenin e gjëndrës dhe ndërmjetësojnë tretshmërinë e spidroinës, por në pH të reduktuar, protonizimi i një numri zinxhirësh anësor të acidit karboksilik çon në dimerizimin e NT me një pKa prej afërsisht 6.5, duke stabilizuar kështu NT dhe duke fiksuar spidroinën në masë të madhe. sasive.rrjetet16,18.Kështu, NT luan një rol kyç në formimin e filamentit, duke ndryshuar nga një monomer në shtresë në një dimer në fibër23,24,25.NT mbetet shumë i tretshëm dhe spirale në të gjitha kushtet e studiuara deri më sot16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, gjë që frymëzoi zhvillimin e saj si një etiketë për rritjen e tretshmërisë për prodhimin e proteinave heterologe.
Proteina rekombinante e mëndafshit të merimangës, e përbërë nga një NT, një rajon i shkurtër përsëritës, një CT dhe një etiketë His6 (His-NT2RepCT) për pastrim, është po aq e tretshme në tampon ujor sa proteina e mëndafshit vendase të merimangës dhe imiton karakteristikat e rëndësishme vendase të merimangës së mëndafshit. .mbulimi 25.31.His-NT2RepCT mund të rrotullohet në fibra të vazhdueshme duke përdorur një makinë biomimetike në të cilën një shtresë e tretshme me pH 8 nxirret në një banjë uji me pH 525,32,33,34,35.Fermentimi bioreaktor i E. coli që shpreh His-NT2RepCT dhe pas-trajtimi pasues rezultuan në rendiment >14 g/L pas pastrimit.Rendimenti i lartë, tretshmëria e lartë dhe përgjigja adekuate e His-NT2RepCT ndaj kushteve acidike i atribuohen të gjitha NT23, 25, 34.
Këtu raportojmë formimin e shpejtë të hidrogeleve transparente nga proteinat spidroin rekombinante, duke përfshirë vetëm NT, duke inkubuar një zgjidhje proteine ​​në 37 °C.Duke përdorur fluoreshencën e tioflavinës T (ThT), spektroskopinë infra të kuqe të transformimit Fourier (FTIR), spektroskopinë e rezonancës magnetike bërthamore (NMR) dhe mikroskopin elektronik të transmisionit (TEM), zbuluam se proteinat NT dhe mikromerimangë i nënshtrohen transformimit strukturor në fletë β dhe fibrile të ngjashme me amiloidin. kur formohen xhel.Përveç kësaj, proteinat e bashkimit të NT dhe proteinës fluoreshente jeshile (GFP) ose fosforilazës nukleozide purine (PNP) formojnë hidrogele me fragmente të shkrirjes plotësisht funksionale.Shprehja me performancë të lartë në hostet heterologë, e shoqëruar me formimin e shpejtë të hidrogeleve në kushte fiziologjike, hap mundësinë e prodhimit me kosto efektive të hidrogeleve me funksione të inxhinieruara.
Ndryshe nga shumica e proteinave spidroin rekombinante të raportuara36, His-NT2RepCT është i qëndrueshëm në tampon Tris-HCl në pH 8 dhe mund të përqendrohet deri në 500 mg/mL pa precipitim25.Prandaj, ne u befasuam kur zbuluam se kjo proteinë formon me shpejtësi hidrogele optikisht të pastër, vetë-mbështetës kur inkubohet në 37°C (Fig. 1b-d).Studime të mëtejshme treguan se xhelimi i His-NT2RepCT ndodhi në një gamë të gjerë përqendrimesh proteinash (10-300 mg/mL) dhe se ky përqendrim ishte i ndërlidhur në mënyrë të kundërt me kohën e xhelatimit (Fig. 1c dhe Fig. Suplementare 1).Për të gjetur se cilat pjesë të His-NT2RepCT ndërmjetësojnë formimin e hidrogelit, më pas ne ekzaminuam çdo domen individualisht dhe në kombinime të ndryshme duke përdorur një analizë të përmbysjes së balonës (Figura 1a,b).Të gjitha fraksionet e testuara të spidroinës rekombinante formuan xhel (me një përqendrim proteine ​​prej 300 mg/mL) në më pak se 1 orë, me përjashtim të 2Rep të precipituar (Fig. 1b).Kjo sugjeron që vetëm NT dhe CT, të kombinuara, ose të shoqëruara me përsëritje, mund të xhelin në 37°C dhe se etiketa His6 nuk ndikon në këtë proces në ndonjë masë të konsiderueshme.Duke pasur parasysh nocionin e zakonshëm që NT është një proteinë shumë e tretshme dhe e qëndrueshme, dhe se raportet e mëparshme të hidrogeleve spidroin rekombinante i kanë atribuar efektet e xhelatimit ndryshimeve konformacionale në rajonet e përsëritura dhe/ose CT, vetë NT mund.Zbulimi i xhelatit ishte i papritur.Tabela Suplementare 1) 37, 38, 39. Çuditërisht, NT tashmë është bërë xhel brenda 10 minutave në një përqendrim prej ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Eksperimentet e përmbysjes së shisheve me përqëndrime të ndryshme të NT treguan se në >50 mg/mL tretësira e NT xhelitet më shpejt se His-NT2RepCT në përqendrimin përkatës (w/v, Figura 1c).
Paraqitja skematike e konstrukteve të ndryshme spidroin të studiuar në këtë punim.b.Xhel CT menjëherë pa inkubacion (<300 mg/mL), precipitat 2Rep (300 mg/mL, shkallë 5 mm).c Koha e xhelit të His-NT2RepCT dhe NT në përqendrimet e treguara të proteinave në 37°C.d Fotografitë e hidrogeleve His-NT2RepCT dhe NT me merimangën dhe shkronjën "NT" të shtypura poshtë, përkatësisht (të dyja 200 mg/mL, shiriti i shkallës 5 mm).
Hidrogelet e formuara nga proteina të ndryshme rikombinante spidroin kanë ngjyra paksa të ndryshme dhe vëzhgimi me sy të lirë tregon shkallë të ndryshme transparence (Fig. 1b).Xhelet NT janë jashtëzakonisht të qarta ndërsa xhelët e tjerë bëhen të errët.Xhelet His-NT2RepCT dhe NT të hedhura në tuba cilindrikë mund të hiqen nga kallëpi i paprekur (Fig. 1d).
Për të testuar nëse xheli i veshjeve natyrale të mëndafshit të merimangës në kushte që tani zbulohet se shkakton xhelatimin e proteinave spidroin rekombinante, u mblodhën veshje nga gjëndra e madhe e ampulës së merimangës së urës suedeze (Larinioides sclopetarius).Veshjet u ruajtën në tampon 20 mM Tris-HCl në 50 mg/mL (bazuar në peshën e thatë të matur), por nuk u vu re xhelatim gjatë inkubacionit 21 ditor në 37 °C (Figura plotësuese 2a).
Për të përcaktuar sasinë e këtyre xheleve, matjet reologjike mund të përdoren për të studiuar procesin e xhelatimit dhe për të përcaktuar vetitë e përgjithshme mekanike.Në veçanti, monitorimi i modulit të ruajtjes (elasticitetit) në temperatura të larta mund të sigurojë informacion mbi temperaturën e xhelit, si dhe vetitë viskoelastike të veshjes.Eksperimentet e rritjes së temperaturës (duke përdorur 1°C/min në 25-45°C, bazuar në studimet e mëparshme duke përdorur zgjidhje natyrale të mëndafshit)40,41 treguan se moduli i ruajtjes së tretësirave His-NT2RepCT dhe NT u rrit me rritjen e temperaturës.u rrit (Fig. 2 dhe Fig. Suplementar 3).Veçanërisht, moduli NT filloi të rritet në një temperaturë më të ulët në krahasim me His-NT2RepCT, në përputhje me kohën më të shpejtë të xhelit të vërejtur kur NT u inkubua drejtpërdrejt me His-NT2RepCT në 37°C (Figura 1).Pas një rënieje të mëvonshme të temperaturës, moduli i ruajtjes nuk u kthye në vlera më të ulëta dhe mbeti mbi modulin e humbjes (shih Fig. 3 shtesë), duke treguar xhelatimin e qëndrueshëm termikisht të pakthyeshëm.Pas xhelatit, moduli përfundimtar elastik varionte nga 15 në 330 kPa për hidrogelet His-NT2RepCT në një përqendrim prej 100-500 mg/mL, dhe moduli përfundimtar elastik për hidroxhelat NT (100-500 mg/mL) varionte nga 2 në 1400 kPa (Fig. , 2 dhe të dhënat e plota të rampës) shih Fig. Suplementare 3).
a Ndryshim i temperaturës gjatë matjeve të His-NT2RepCT (300 mg/mL) dhe b NT (300 mg/mL) me lëkundje.Shigjetat tregojnë tendencën e temperaturës dhe hijezimi më i lehtë i të dhënave të modulit të ruajtjes përshkruan testimin me vlera më të ulëta të çift rrotullimit për instrumentin sesa specifikohet nga prodhuesi, gjë që është shkaku i rritjes së zhurmës.c Akumulimi në fund të modulit të His-NT2RepCT dhe NT pas temperaturës së ngritur (100, 300 dhe 500 mg/mL).Të gjitha leximet e modulit merren me një frekuencë prej 0.1 Hz.
Si një metodë e mundshme për hetimin e ndryshimeve konformacionale të lidhura me xhelatimin, ne regjistruam spektrat FTIR të His-NT2RepCT dhe NT para dhe pas xhelatimit në 37°C (Figura 3a,b).Siç pritej, spektri i tretësirave His-NT2RepCT dhe NT korrespondonte me proteinat që tregonin strukturën dytësore të α-spiralës/spiralës së rastësishme, me një brez të theksuar në 1645 cm-1.Për të dy hidrogelat, xhelatimi rezultoi në formimin e dy krahëve në brezin e mesëm I në rreth 1617 cm-1 dhe 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), që tregon formimin e strukturave antiparalele të fletës β.Këto ndryshime mund të shihen qartë edhe në spektrat përkatëse të xhelatimit të derivatit të dytë dhe të diferencës (Figura suplementare 4b).Dy brezat e shtresës β-NT ishin më të theksuara se ato të His-NT2RepCT, gjë që tregon se përmbajtja totale e brezave të shtresës β në hidrogelin NT ishte më e lartë se ajo e hidrogelit NT2RepCT.
një spektër absorbues FTIR të His-NT2RepCT dhe b NT (të dyja 500 mg/mL) para (tretësirës) dhe pas (xhelit) inkubimit në 37°C.c Imazhet TEM të xhelit të risuspenduar 50 mg/ml NT2RepCT dhe d NT.Shiriti i shkallës 200 nm.e Diametrat e fibrave të hidrogeleve His-NT2RepCT dhe NT.n = 100 fibrile të matura, p < 0,0001.Shiritat e gabimit tregojnë devijimin standard.Qendra e shiritave të gabimit është mesatarja.Për analizën statistikore u përdor një T-test i paçiftuar (me dy bisht).f ThT fluoreshencë e proteinave të ndryshme rekombinante spidroin (100 mg/mL) në 37 °C pa tundje.g NT (100 mg/mL) eksperimente të vaksinimit nga 100 mg/mL xhel NT me 0%, 5%, 10% dhe 20% fara.
Analiza e xhelit duke përdorur mikroskopin elektronik transmetues (TEM) tregoi se hidrogeli përbëhet nga fibrile të ngjashme me amiloidin (Fig. 3c, 3d).Fibrilet e formuara nga NT ishin të zgjatura (në diametër 5-12 nm) dhe të padegëzuara, ndërsa fibrilet e His-NT2RepCT ishin më të shkurtra në gjatësi dhe dukshëm më të gjera në diametër (7-16 nm) (Fig. 3e).Këto rezultate na lejuan të ndiqnim kinetikën e fibrozës duke përdorur analizën e tioflavinës T (ThT).Për të gjitha proteinat spidroin rekombinante, sinjali fluoreshent u rrit kur mostrat u inkubuan në 37 °C (Fig. 3f, Fig. Suplementare 5a).Në përputhje me këtë gjetje, ekzaminimi mikroskopik i NT dhe His-NT2RepCT në kushtet e xhelit zbuloi një rritje uniforme të fluoreshencës ThT pa akumulim të dukshëm lokal të agregateve ThT-pozitive (Figura suplementare 5b,c).Formimi i fibrileve ThT-pozitive nuk u shoqërua me një rritje të turbullirës së NT dhe His-NTCT (Fig. Suplementare 5d), që do të thotë se një rrjet fibrilash në xhel mund të formohej pa kompromentuar qartësinë e xhelit.Mbjellja duke shtuar sasi të vogla fibrilesh të para-formuara mund të përshpejtojë ndjeshëm formimin e fibrilit të disa amiloideve42,43,44 por duke shtuar 5%, 10% ose 20% (w/w) NT në një tretësirë ​​të hidrokoagulantëve NT.efekt mbjellës (Fig. 3g).Ndoshta kjo për faktin se fibrilet në hidrogel janë relativisht të fiksuara dhe nuk mund të përdoren si fara.
Sjellja e papritur e proteinave spidroin rekombinante në temperatura të larta nxiti studime të mëtejshme të spektroskopisë së rezonancës magnetike bërthamore (NMR) për të identifikuar ndryshimet konformacionale që lidhen me formimin e xhelit.Spektrat NMR të zgjidhjeve His-NT2RepCT të regjistruara me kalimin e kohës në 37°C treguan se CT ishte ende pjesërisht e palosur, ndërsa sinjalet NT dhe 2Rep ishin zhdukur (Fig. 4a), duke sugjeruar se ishte kryesisht NT dhe 2Rep që kontrollonte pjesërisht formimin e His- Hidrogel NT2RepCT.Sinjali CT u zbut gjithashtu në 20% të intensitetit të tij origjinal, duke sugjeruar që CT është gjithashtu kryesisht i fiksuar dhe i inkorporuar në strukturën e hidrogelit.Për një pjesë më të vogël të CT, e cila është po aq e lëvizshme sa në mostrën e parainkubuar dhe e vëzhguar kështu nga solucioni NMR, spektrit i mungojnë sinjalet për 10 mbetjet e para të strukturuara, ndoshta për shkak të imobilizimit të vështirë të pjesës së bashkangjitur të His-NT2Rep.Spektrat NMR të gjendjes së hidrogeleve -NT2RepCT zbuluan praninë mbizotëruese të α-helikave dhe shtresave β dhe, në një masë më të vogël, konformimin e rastit të spirales (Fig. 4b).Analiza e zhvendosjes kimike të mbetjeve të metioninës të pranishme vetëm në NT tregoi se ky domen ishte konvertuar në një strukturë fletë β.Spektrat e varur nga koha e NT në tretësirë ​​treguan një rënie uniforme në intensitetin e sinjalit (Fig. 4c), dhe NMR në gjendje të ngurtë të hidrogeleve NT tregoi se shumica e mbetjeve NT u konvertuan në strukturat e fletës β (Fig. 4d).Konformacioni i 2Rep nuk mund të përcaktohet veçmas për shkak të tendencës së tij për t'u grumbulluar.Megjithatë, spektri i gjendjes së ngurtë NMR të hidrogeleve NTCT dhe His-NT2RepCT dukeshin shumë të ngjashme (Fig. 4b; Fig. Suplementare. 6b), duke sugjeruar që 2Rep kontribuoi pak në pjesën strukturore të hidrogelit His-NT2RepCT.Për hidrogelet CT, u gjetën α-spira, β-fletë dhe struktura sekondare spirale të rastësishme (Fig. 6d plotësuese).Kjo sugjeron që disa pjesë të CT mbeten α-helika ndërsa të tjerat bëhen fletë β.Kështu, rezultatet e spektroskopisë NMR sugjerojnë se NT është i rëndësishëm për formimin e hidrogelit dhe gjithashtu shndërrohet në një konformacion të fletës β pas shkrirjes me 2Rep dhe CT.Në përputhje me këtë, kohët e fundit zbuluam se zinxhirët hapësinorë amiloide ka të ngjarë të formohen në të pesë helikset e domenit NT dhe algoritmi Waltz parashikoi një rajon amiloidogenic në spiralen 1 (Fig. 4e).
Spektrat 2D të tretësirës 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT para (blu) dhe 19 orë pas inkubimit (e kuqe) në 37°C.Majat kryq individuale në spektrin e kuq dhe F24, G136, polyA në spektrin blu shënohen me simbole të aminoacideve me një shkronjë të vetme dhe numra mbetjesh.Insett tregojnë varësinë e intensitetit të sinjalit në kohë për mbetjet e zgjedhura nga domenet NT, 2Rep dhe CT.b Spektrat e radiofrekuencës në gjendje të ngurtë (RFDR) të hidrogeleve His-NT2RepCT.Korrelacionet e mbetjeve të Ca/Cβ të vëzhguara në spektrat RFDR u përcaktuan duke krahasuar me zhvendosjet kimike të modelit të peptideve dhe vlerat e nxjerra nga statistikat82,83 dhe strukturat e tyre dytësore.SSB - brez anësor rrotullues.c Spektrat njëdimensionale të tretësirës 15N-HSQC 10 mg/mL NT gjatë inkubacionit në 37 °C për 36 orë.Futja tregon intensitetin vëllimor kundrejt kohës.d Spektrat RFDR në gjendje të ngurtë të hidrogeleve NT.Tregohen korrelacionet e mbetjeve Ca/Cβ dhe strukturave të tyre dytësore të vëzhguara në spektrat RFDR.e Bazuar në profilin e prirjes së fibrilimit NT45.79 nga baza e të dhënave Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Energjia Rosetta e dritares hapësinore të zhvendosjes së rrufesë të hexapeptidit tregohet në kcal/mol.Shiritat e kuq tregojnë heksapeptide me prirje të lartë fibroze (energjia e Rozetës nën -23 kcal/mol; nën vijën me pika).Shiritat jeshil tregojnë fragmente me energji Rozeta mbi pragun dhe për këtë arsye më pak gjasa për të formuar zinxhirë sterikë.Fragmentet që përmbajnë prolinë janë përjashtuar nga analiza (pa kolona).Sheshat tregojnë zonat e amiloidozës të parashikuara nga algoritmi Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Sekuenca e mbetjeve të aminoacideve të NT është në krye, dhe llojet e mbetjeve që gjenden në strukturën dytësore β (të përcaktuara nga spektroskopia NMR në gjendje të ngurtë) tregohen me të kuqe.Pozicionet e pesë NT α-helikave janë caktuar si (H1-H5)28.
Në pH <6,5, HT dimerizohet, duke qenë rezistent ndaj denatyrimit të shkaktuar nga nxehtësia ose ure18.Për të sqaruar se si dimerizimi dhe stabiliteti i NT ndikojnë në xhelatimin, solucionet që përmbajnë 100 mg/ml NT u kontrolluan në pH 8, 7 dhe 6 duke përdorur testin e përmbysjes së shisheve.Mostrat NT u inkubuan në pH 8 dhe 7 u bënë xhel pas 30 minutash në 37 ° C, por xhel me pH 8 mbeti i qartë, ndërsa xhel me pH 7 tregoi një precipitat të dukshëm (Fig. 5a).Në të kundërt, një zgjidhje që përmban HT në pH 6 nuk formoi një xhel dhe një precipitat i madh mund të shihej pas 20 minutash në 37 ° C.Kjo sugjeron që vetë dimerët dhe/ose qëndrueshmëria e tyre më e lartë në krahasim me monomerët parandalojnë xhelatimin.Formimi i një precipitati për NT në pH 7 dhe 6 nuk pritej, pasi është raportuar se NT është i tretshëm në 200 mg/ml27, ripaloset lehtësisht pas denatyrimit të nxehtësisë dhe gjithashtu ruan një spirale α në vlera më të ulëta të pH 18. Një shpjegim i mundshëm për këto mospërputhje është se eksperimentet e raportuara më parë janë kryer në temperaturë dhome ose më poshtë, ose në përqendrime relativisht të ulëta të proteinave16,18,19.
Testi i përmbysjes së shishkës NT (100 mg/mL) në pH 8, 7, 6 dhe 154 mM NaCl (pH 8) pas inkubimit në 37°C.b spektrat NT CD me dhe pa 154 mM NaF dhe 154 mM NaCl, respektivisht.Elipticiteti molar në 222 nm konvertohet në një proporcion të palosjeve natyrore.c Analiza e përmbysjes së NT (100 mg/mL) NT* (37 °C dhe 60 °C), NTA72R (37 °C) dhe His-NT-L6 (37 °C dhe 60 °C).d spektrat CD të mutantëve NT NT*, NTA72R dhe His-NT-L6.Elipticiteti molar në 222 nm konvertohet në një proporcion të palosjeve natyrore.e Testi i inversionit të NTFlSp, NTMiSp dhe NTMiSp të reduktuar (100 mg/mL).Shiriti i shkallës 5 mm.f spektrat CD të NT, NTFlSp, NTMiSp dhe NTMiSp të reduktuar.Elipticiteti molar në 222 nm konvertohet në një proporcion të palosjeve natyrore.Spektrat e plotë të NT në 25 °C dhe 95 °C tregohen në figurën plotësuese 8.
Përqendrimi fiziologjik i kripës përcakton ndërveprimet elektrostatike midis nënnjësive NT dhe dimerizimin e transferimit të NT në pH18 më të ulët.Ne zbuluam se prania e 154 mM NaCl dhe NaF frenonte me të vërtetë xhelatimin, përkatësisht (Fig. 5a, b; Fig. Suplementare 2b) dhe se këto kripëra rritën qëndrueshmërinë termike të monomerëve NT (Fig. 5b, Fig. Suplementare 8). .Ai gjithashtu sugjeron që rritja e stabilitetit, në vend të dimerizimit, parandalon formimin e xhelit.
Për të eksploruar më tej rolin e dimerizimit të proteinave dhe qëndrueshmërisë në gelim, ne përdorëm dy mutantë, NT* dhe NTA72R, të cilët gjithashtu mbeten monomerë në pH të ulët 28.30.NT* është një mutant i kthimit të dyfishtë të ngarkesës në të cilin shpërndarja e dukshme e ngarkesës dipolare e monomerit është rrafshuar, gjë që parandalon dimerizimin dhe rrit në mënyrë drastike stabilitetin e monomerit.NTA72R është një dipol i ngarkuar, por Ala e zëvendësuar me Arg ndodhet në kufirin e dimerit, kështu që mutacionet ndërhyjnë në ndërveprimet e nënnjësive të kërkuara për dimerizim.Pas inkubimit në 37°C, NT* nuk formoi një hidrogel, ndërsa NTA72R formoi një xhel të errët për 15 minuta (Fig. 5c).Meqenëse të dy NT* dhe NTA72R nuk mund të dimerizohen, por ndryshojnë në qëndrueshmërinë e monomerit (Fig. 5d), këto rezultate sugjerojnë fuqimisht se stabiliteti i lartë termodinamik pengon NT nga xheli.Kjo mbështetet edhe nga fakti se HT* formon një xhel kur është i paqëndrueshëm në temperaturë të lartë (pas 8 minutash në 60°C; Fig. 5c).Më parë është treguar se përmbajtja e lartë e metioninës në NT e lëngëzon palosjen e saj natyrale dhe se gjashtë zëvendësues Met to Leu (të referuar këtu si His-NT-L6) stabilizojnë fuqishëm monomerin NT46.Bazuar në supozimin se fleksibiliteti strukturor kërkohet për formimin e xhelit NT, ne zbuluam se mutant i qëndrueshëm His-NT-L6 nuk u bë xhel në 37 °C (Figura 5c, d).Megjithatë, His-NT-L6 gjithashtu formoi një xhel pas inkubimit në 60°С për 60 minuta (Fig. 5c).
Aftësia e NT për t'u transformuar në struktura të fletës β dhe për të formuar hidrogele duket se zbatohet për disa, por jo të gjitha domenet NT të spidroinës.NT nga lloje të ndryshme mëndafshi dhe lloje merimangash, Trichonephila clavipe (NTFlSp), formuan xhel pavarësisht nga përmbajtja e tyre relativisht e ulët e metioninës dhe qëndrueshmëria e lartë termike (Fig. 5e, f dhe Tabela plotësuese 2).Në të kundërt, NT nga proteina e vogël ampullare spidroin nga Araneus ventricosus (NTMiSp) me qëndrueshmëri të ulët termike dhe përmbajtje të lartë metionine nuk formoi hidrogel (Tabela plotësuese 2 dhe Fig. 5e, f).Kjo e fundit mund të shoqërohet me praninë e lidhjeve disulfide intramolekulare29,47.Në mënyrë të vazhdueshme, kur lidhjet disulfide të NTMiSp u reduktuan, ai formoi një hidrogel pas inkubimit në 37°C për 10 minuta (Fig. 5e).Si përfundim, duhet theksuar se fleksibiliteti strukturor është një kriter i rëndësishëm, por jo i vetmi, për formimin e një xheli nga NT.Një faktor tjetër që mund të jetë i rëndësishëm është prirja për të formuar fibrile amiloide, dhe analiza me bazën e të dhënave të zinxhirit dhe algoritmin Waltz tregoi një korrelacion midis aftësisë për të formuar xhel dhe pranisë së rajoneve amiloide, si dhe shtrirjes së rajoneve të parashikuara. për të formuar zinxhirë sterikë.Kishte një korrelacion (Tabela Plotësuese 2 dhe Fig. Suplementare 9).
Aftësia e NT për të formuar fibrile dhe për të formuar xhel në kushte të favorshme na bëri të hipotezojmë se bashkimet e NT me fragmente të tjera proteinash mund të formojnë akoma xhel me funksion të plotë të partnerëve të shkrirjes.Për ta testuar këtë, ne futëm proteinën fluoreshente jeshile (GFP) dhe fosforilazën nukleozide purine (PNP) në fundin C të NT, përkatësisht.Proteinat e shkrirjes që rezultuan u shprehën në E. coli me rendimente përfundimtare shumë të larta (150 mg/L dhe 256 mg/L kultura me balonë shkundëse për His-NT-GFP dhe His-NT-PNP, respektivisht), në përputhje me atë që është treguar. për proteina të tjera të shkrira me NT Ref.30. Proteinat e bashkimit His-NT-GFP (300mg/mL) dhe His-NT-PNP (100mg/mL) formuan xhel pas 2 orësh dhe 6.5 orësh në 37°C dhe, më e rëndësishmja, fraksioni GFP mbeti i pandryshuar.vërehet pas xhelatimit, me >70% të intensitetit fillestar të fluoreshencës që mbetet pas xhelatimit (Fig. 6a).Për të matur aktivitetin e PNP në solucionet dhe xhelat e tij-NT-PNP, na u desh të hollojmë proteinën e shkrirjes me NT sepse aktiviteti enzimatik i preparatit të pastër ishte jashtë gamës së zbulimit të analizës në përqendrimet e xhelit.Xheli i formuar me një përzierje që përmban 0.01 mg/mL His-NT-PNP dhe 100 mg/mL NT ruajti 65% të aktivitetit enzimatik fillestar të mostrave të parainkubuara (Fig. 6b).Xheli mbeti i paprekur gjatë matjes (Fig. Suplementare 10).
një intensitet relativ i fluoreshencës para dhe pas xhelimit të His-NT-GFP (300 mg/mL) dhe shishkës së përmbysur që përmban hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) nën dritën e dukshme dhe UV.Pikat tregojnë matjet individuale (n = 3), shiritat e gabimit tregojnë devijimin standard.Vlera mesatare tregohet në qendër të shiritave të gabimit.b Aktiviteti i PNP u përftua nga analiza fluorometrike duke përdorur solucione dhe xhel të përbërë nga NT (100 mg/ml) dhe një përzierje që përmban 0.01 mg/ml his-NT-PNP dhe 100 mg/ml dollarë të rinj Tajvan.Pjesa e brendshme tregon një shishkë të përmbysur që përmban një hidrogel që përmban His-NT-PNP (bar shkallës 5 mm).
Këtu, ne raportojmë formimin e hidrogeleve nga NT dhe proteinat e tjera rikombinante spidroin duke inkubuar një zgjidhje proteine ​​në 37°C (Figura 1).Ne tregojmë se xhelatimi shoqërohet me transformimin e α-helikave në shtresa β dhe formimin e fibrileve të ngjashme me amiloidin (Fig. 3 dhe 4).Ky zbulim është befasues pasi NT-të janë tufa globulare me pesë spirale të mbështjellura të njohura për tretshmërinë e tyre jashtëzakonisht të lartë dhe stabilitetin e lartë në përqendrime >200 mg/mL në 4°C për disa ditë27.Përveç kësaj, NT-të palosen lehtësisht pas denatyrimit të nxehtësisë në përqendrime të ulëta të proteinave në μM.Sipas rezultateve tona, formimi i fibrilit kërkon një kombinim të përqendrimit të proteinës >10 mg/mL dhe temperaturës pak të ngritur (Fig. 1).Kjo është në përputhje me idenë se fibrilet amiloide mund të formohen nga proteinat e palosur në formë globulare që janë në një gjendje pjesërisht të shpalosur për shkak të luhatjeve termike në kushte fiziologjike 48 .Shembuj të proteinave që i nënshtrohen këtij shndërrimi përfshijnë insulinën49,50, β2-mikroglobulinën, transtiretinën dhe lizozimën51,52,53.Edhe pse NT është një α-spiral në gjendjen e tij amtare, afërsisht 65% e zinxhirit polipeptid është në përputhje me formimin e zinxhirit sterik (Fig. 4e) 45 .Meqenëse monomeri është dinamikisht i lëvizshëm46, ai mund t'i ekspozojë këto rajone potenciale amiloidogjene në temperatura mesatarisht të ngritura dhe në përqëndrime të larta të proteinës totale mund të arrijë një përqendrim kritik për formimin e fibrileve amiloide54.Pas këtij arsyetimi, ne gjetëm një korrelacion negativ midis përqendrimit të spidroinës dhe kohës së xhelatimit (Fig. 1c), dhe nëse konformacioni monomerik NT stabilizohet ose nga mutacionet (NT*, His-NT-L6) ose nga shtimi i kripës, mund të parandalojë hidrogelet e formimit (Fig. 5).
Në shumicën e rasteve, fibrilet amiloide zhduken nga tretësira si një precipitat, por në kushte të caktuara ato mund të formojnë hidrogel55,56,57.Fibrilet që formojnë hidrogel zakonisht kanë një raport të lartë pamjeje dhe formojnë rrjete të qëndrueshme tre-dimensionale përmes ngatërrimit molekular, 55,58 në përputhje me rezultatet tona.Për formimin e hidrogelit in vitro, proteinat shpesh shpalosen plotësisht ose pjesërisht, për shembull, nga ekspozimi ndaj tretësve organikë, temperaturës së lartë (70-90°C) dhe/ose pH të ulët (1,5-3,0) 59,60,61,62.Hidrogelët spidroin të përshkruar këtu nuk kërkojnë përpunim të ashpër dhe as nuk kërkojnë agjentë ndërlidhës për të stabilizuar hidrogelet.
Më parë është raportuar se përsëritjet e spidroinës dhe QD-të, të cilat duket se i nënshtrohen ndërrimit të fletës β gjatë tjerrjes së mëndafshit, formojnë hidrogel.Krahasuar me gjetjet tona, kohët e inkubacionit dhe/ose temperaturat e inkubacionit ishin respektivisht dukshëm më të gjata ose më të larta, dhe hidrogelet rezultuese ishin shpesh opake (Figura 7 dhe Tabela Suplementare 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Përveç kohëve të shpejta të xhelit, hidrogelet NT >300 mg/mL (30%) ia kalonin të gjitha hidrogeleve të tjera të përshkruara me proteina të mëndafshit të merimangës rekombinante, si dhe hidrogelet natyrale si xhelatina, alginati (2%), agari (0,5 %) ) dhe kolagjenit.(0.6%) (Figura 7 dhe Tabelat Plotësuese 1 dhe 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Koha e xhelit dhe moduli i elasticitetit të hidrogeleve në këtë studim u krahasuan me hidrogela të tjerë me bazë spidroin dhe hidrogela natyralë të zgjedhur.Referencat janë dhënë së bashku me një përshkrim të kushteve të xhelatimit.APS Persulfat i amonit, temperaturë dhome.Të dhënat 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Merimangat duket se kanë zhvilluar mënyra për të parandaluar xhelin e spidroinës gjatë ruajtjes.Pavarësisht përqendrimit të lartë të proteinave në gjëndrën e mëndafshit, rajoni i madh i përsëritjes i lidhur me domenin terminal do të thotë se përqendrimi i dukshëm i NT dhe CT në gjëndër korrespondon me afërsisht 10-20 mg/ml, në kufirin e këtij studimi.kërkohet për formimin e hidrogelit të vëzhguar in vitro.Përveç kësaj, përqendrimet e ngjashme të kripërave 16 stabilizuan NT, si në gjëndrat e mëndafshit (Fig. 5b).Konformimi i NT është studiuar në citozolin E. coli dhe është gjetur të jetë më i palosur sesa kur ekzaminohet in vitro, duke treguar më tej se kripa ose faktorë të tjerë pengojnë grumbullimin e saj in vivo.Megjithatë, aftësia e NT për t'u transformuar në fibrile të fletës β mund të jetë e rëndësishme për formimin e filamentit dhe duhet të hetohet në studimet e ardhshme.
Përveç aspekteve të reja të formimit të fibrilit dhe hidrogelit të ngjashëm me NT-amiloide të vëzhguara në këtë studim, ne tregojmë gjithashtu se ky fenomen mund të ketë aplikime bioteknologjike dhe biomjekësore (Fig. 8).Si provë e konceptit, ne kombinuam NT me GFP ose PNP dhe treguam se proteina e shkrirjes formon gjithashtu hidrogel kur inkubohet në 37 °C dhe se fraksionet GFP dhe PNP ruajnë kryesisht aktivitetin e tyre pas xhelatimit (Figura 6).Fosforilazat nukleozide janë katalizatorë të rëndësishëm të sintezës së analogëve të nukleozideve75, gjë që e bën zbulimin tonë të rëndësishëm për industrinë biofarmaceutike.Koncepti i shprehjes së proteinave të shkrirjes që formojnë hidrogele transparente në kushte të favorshme lejon krijimin e hidrogeleve të funksionalizuara me veti të favorshme për një gamë të gjerë aplikimesh si imobilizimi i enzimës, çlirimi i kontrolluar i barnave dhe inxhinieria e indeve.Për më tepër, NT dhe NT* janë shënues shprehjeje efikase30, që do të thotë se NT dhe variantet e tij mund të përdoren për prodhimin e proteinave të shkrirjes me performancë të lartë dhe krijimin e mëvonshëm të proteinave të synuara të imobilizuara në hidrogelet 3D.
NT është i tretshëm, α-spiral dhe i qëndrueshëm në përqendrime të ulëta (μM) dhe 37°C.Në të njëjtën temperaturë, por në përqendrime në rritje (>10 mg/ml), NT formon xhel të përbërë nga fibrile të ngjashme me amiloidin.Proteinat e shkrirjes NT gjithashtu formojnë xhel fibrilar me fragmente të shkrirjes plotësisht funksionale, duke lejuar që proteinat e ndryshme të imobilizohen në hidrogel 3D duke përdorur NT.Fundi: NT (PDB: 4FBS) dhe ilustrime të rrjeteve të fibrave dhe strukturave proteinike të lidhura (të supozuara dhe jo të tërhequra në shkallë, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2pdbd1).
Konstruktet (shih Tabelën Suplementare 4 për një listë të plotë duke përfshirë sekuencat e aminoacideve) u klonuan në plazmidin pT7 dhe u transformuan në E. coli BL21 (DE3).E. coli që përmbanin plazmide të modifikuara u inokuluan në lëngun e Luria-s të plotësuar me kanamicinë (70 mg/l) dhe u rritën gjatë natës në 30°C dhe 250 rpm.Më pas kultura u inokulua 1/100 në mjedisin LB që përmban kanamicinë dhe u kultivua në 30°C dhe 110 rpm derisa OD600 arriti 0.8.Për studimet NMR, bakteret u rritën në mjedis minimal M9 që përmban 2 g D-glukozë 13C (Aldrich) dhe 1 g klorur amoniumi 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) për etiketimin e proteinave me izotope.Uleni temperaturën në 20 gradë Celsius dhe nxisni shprehjen e proteinave me 0.15 mM izopropiltiogalaktopiranoside (përqendrimi përfundimtar).Pas shprehjes së proteinave gjatë natës, qelizat u mblodhën në 7278 × g, 4 ° C për 20 min.Peletat e qelizave u risuspenduan në 20 mM Tris-HCl, pH 8 dhe u ngrinë deri në përdorim të mëtejshëm.Qelizat e shkrira u lizuan duke përdorur një ndërprerës të qelizave (makinat e serisë TS, Constant Systems Limited, Angli) në 30 kPa.Më pas lizat u centrifuguan në 25000 g për 30 minuta në 4°C.Për NTMiSp, peleti u risuspendua më pas në 2 M ure, 20 mM Tris-HCl, pH 8 dhe u sonikua për 2 minuta (2 s ndezje/fikje, 65%), më pas u centrifugua përsëri në 25,000 xg, 4 ° C. 30 min.Supernatanti u ngarkua në një kolonë Ni-NTA, u larë me 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, dhe në fund proteina u elua me 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. Për të gjeneruar NT2RepCT dhe NTCT, tretja e trombinës prezanton vendin (ThrCleav) midis His dhe NT.Vendet e ndarjes së trombinës janë gjithashtu të pranishme në His-NT-ThrCleav-2Rep (prodhon 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (prodhon NT), His-tioredoxin-ThrCleav-CT (prodhon CT), His-Tioredoxin-ThrCleav-NT .* (prodhon NT*), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTA72R (prodhon NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (prodhon NTF1Sp) dhe His-Sulphur Redoksin-ThrCleav-NTMiSp (prodhon).Konstruktet u tretën me trombinë (1:1000) dhe u dializuan gjatë natës në 4° C. me 20 mM Tris-HCl, pH 8, duke përdorur një membranë dialize Spectra/Por me një prag peshe molekulare 6-8 kDa.Pas dializës, tretësira ngarkohet në një kolonë Ni-NTA dhe grumbullohet efluenti që përmban proteinën e interesit.Përqendrimet e proteinave u përcaktuan duke matur absorbimin e UV në 280 nm duke përdorur koeficientin e zhdukjes së secilës proteinë, me përjashtim të NTF1Sp, i cili përdori analizën Bradford sipas protokollit të prodhuesit.Pastërtia u përcaktua nga SDS poliakrilamid (4-20%) elektroforezë xhel dhe ngjyrosje blu e shkëlqyeshme Coomassie.Proteinat u përqendruan duke përdorur filtra centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) në 4000 xg me një ndërprerje të peshës molekulare 10 kDa në cikle 20 minutash.
Shkrini tretësirën e proteinës dhe futni me kujdes 150 µl në një shishkë të qartë septum prej 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tubat u mbuluan dhe u mbyllën me parafilm për të parandaluar avullimin.Mostrat (n = 3) u inkubuan në 37°C ose 60°C dhe u përmbysën periodikisht për të vëzhguar xhelatimin.Mostrat që nuk u bënë xhel u inkubuan për të paktën një javë.Reduktoni lidhjet disulfide NTMiSp me 10 mM DTT për 10 µM proteinë.Për të analizuar xhelatimin e veshjeve natyrale të mëndafshit të merimangës, merimanga e urës suedeze u pre, dy gjëndrat kryesore të ampulluara u vendosën në 200 μl bufer Tris-HCl 20 mM pH 8 dhe u prenë për të lejuar ndarjen e veshjes nga gjëndrat..Përmbajtja e gjëndrave shpërndahet në tampon, 50 µl për përcaktimin e peshës së thatë (me inkubimin e flakoneve të hapura në 60 °C deri në peshë konstante) dhe 150 µl për xhelatimin në 37 °C.
Gjeometria/mjeti matës është prej çeliku inox duke përdorur një pllakë paralele me diametër të sipërm 20 mm dhe një hendek prej 0,5 mm.Ngroheni kampionin nga 25 °C në 45 °C dhe përsëri në 25 °C me një shpejtësi prej 1 °C në minutë duke përdorur një pllakë të poshtme prej çeliku inox Peltier.Matjet vibruese u kryen në një frekuencë prej 0,1 Hz dhe në rajonin viskoelastik linear të materialit në një tendosje prej 5% dhe 0,5% për mostrat prej 100 mg/mL dhe 300-500 mg/mL, respektivisht.Përdorni një dhomë lagështie të personalizuar për të parandaluar avullimin.Të dhënat u analizuan duke përdorur Prism 9.
Për mbledhjen e spektrave infra të kuqe (IR) në temperaturën e dhomës nga 800 në 3900 cm–1.Pajisja ATR, si dhe rruga e dritës përmes spektrometrit, pastrohet me ajër të thatë të filtruar para dhe gjatë eksperimentit.Zgjidhjet (500 mg/mL për të minimizuar majat e përthithjes së ujit në spektra) u futën me pipetë mbi kristale dhe xhel (500 mg/mL) u formuan përpara matjes dhe më pas u transferuan te kristalet (n = 3).U regjistruan 1000 skanime me një rezolucion prej 2 cm-1 dhe zero ciklin e punës prej 2. Derivati ​​i dytë u llogarit duke përdorur OPUS (Bruker) duke përdorur një gamë zbutjeje prej nëntë pikësh.Spektrat u normalizuan në të njëjtin rajon integrimi midis 1720 dhe 1580 cm-1 duke përdorur F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.Në spektroskopinë ATR-IR, thellësia e depërtimit të një rreze infra të kuqe në një kampion varet nga numri i valës, duke rezultuar në një përthithje më të fortë në numrat e valëve më të ulët se sa në numrat më të lartë.Këto efekte nuk janë korrigjuar për spektrat e paraqitur në Fig.3 sepse janë shumë të vogla (Fig. 4 plotësuese).Spektrat e korrigjuar për këtë shifër janë llogaritur duke përdorur softuerin Bruker OPUS.
Në parim, një kuantifikim gjithëpërfshirës i konformacioneve të proteinave është i mundur pas dekonvolucionit të besueshëm të përbërësve brenda pikut të amidit I.Megjithatë, në praktikë lindin disa pengesa.Zhurma në spektër mund të shfaqet si maja (false) gjatë dekonvolucionit.Për më tepër, kulmi për shkak të përkuljes së ujit përkon me pozicionin e pikut të amidit I dhe mund të ketë një madhësi të ngjashme për mostrat që përmbajnë një sasi të madhe uji, siç është xheli ujor i studiuar këtu.Prandaj, ne nuk u përpoqëm të zbërthejmë plotësisht majën e amidit I, dhe vëzhgimet tona duhet të konsiderohen vetëm në mbështetje të metodave të tjera si spektroskopia NMR.
Tretësirat prej 50 mg/ml NT dhe His-NT2RepCT u xhelatuan gjatë natës në 37°C.Hidroxheli u hollua më pas me 20 mM Tris-HCl (pH 8) në një përqendrim prej 12.5 mg/ml, u tund mirë dhe u hollua me pipetë për të thyer xhelin.Më pas, hidrogeli u hollua 10 herë me 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl e kampionit u vendos në një rrjet bakri të veshur me formvar dhe kampioni i tepërt u hoq me letër blotting.Mostrat u lanë dy herë me 5 µl ujë MilliQ dhe u ngjyrosën me 1% format uranil për 5 minuta.Hiqni njollën e tepërt me letër absorbuese, më pas thajeni rrjetën me ajër.Imazhi u krye në këto rrjeta duke përdorur një FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN që funksionon në 100 kV.Imazhet u regjistruan në zmadhim x 26,500 dhe x 43,000 duke përdorur një kamerë Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Gjermani).Për çdo mostër (n = 1), u regjistruan 10-15 imazhe.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) është përdorur për analizën e imazhit dhe matjen e diametrave të fibrave (n = 100, fibra të ndryshme).Prism 9 u përdor për të kryer teste t të paçiftuara (me dy bishta).Mesatarja e fibrileve His-NT2RepCT dhe NT ishin përkatësisht 11,43 (SD 2,035) dhe 7,67 (SD 1,389) nm.Intervali i besimit (95%) është -4.246 në -3.275.shkallë lirie = 198, p < 0,0001.
80 µl mostra të lëngshme që përmbajnë 10 µM tioflavin T (ThT) u matën në tre kopje (n = 3) në kushte statike duke përdorur pllaka Corning me fund të pastër me fund të zi me 96 pus (Corning Glass 3881, USA).Dallimet e fluoreshencës u regjistruan duke përdorur një filtër ngacmimi 440 nm dhe një filtër emetimi 480 nm (FLUOStar Galaxy nga BMG Labtech, Offenburg, Gjermani).Sinjali ThT nuk ishte as i ngopur dhe as i shuar, pasi eksperimentet me përqëndrime të ndryshme të ThT u kryen pa ndryshuar intensitetin e sinjalit.Regjistroni thithjen në 360 nm për matjen e mjegullës.Për eksperimentet e mbjelljes, xhel 100 mg/mL u formuan në 37°C, u risuspenduan dhe u përdorën për mbjellje në raporte molare prej 5%, 10% dhe 20%.Të dhënat u analizuan duke përdorur Prism 9.
Shkrini rezervat e His-NT2RepCT dhe NT >100 mg/mL në akull dhe filtroni përmes një filtri 0,22 µm.Përqendrimet u llogaritën duke matur thithjen në 280 nm duke përdorur Nanodrop.Në puset e një pllake të zezë jo-lidhëse 96 pusesh (Corning) me një fund të pastër, mostrat u holluan në 20 mg/ml në 20 mM Tris-HCl pH 8 dhe u përzien me 5 μM ThT (përqendrimi përfundimtar), përqendrimi total i mostrës Vëllimi 50 μl.Mostrat u imazhuan çdo 10 minuta në 37 °C në një mikroskop CellObserver (Zeiss) me kanal drite të transmetuar dhe grupe filtri për ngacmimin dhe emetimin FITC për imazhin ThT.Një lente 20x/0.4 përdoret për imazhe.Zen Blue (Zeiss) dhe ImageJ (https://imagej.nih.gov/) janë përdorur për analizën e imazhit.Xhel u përgatitën gjithashtu nga solucionet NT dhe His-NT2RepCT në një përqendrim prej 50 mg/mL që përmban 20 mM Tris pH 8 dhe 5 μM ThT dhe u inkubuan në 37°C për 90 min.Pjesët e xhelit u transferuan në një pus të ri që përmban 20 mM Tris, pH 8 dhe 5 μM ThT në një pllakë të zezë jo-detyruese me 96 pus të pastër.Merrni imazhe me fluoreshencë të gjelbër dhe në fushë të ndritshme me zmadhim 20x/0,4.ImageJ është përdorur për analizën e imazhit.
Spektrat NMR të tretësirës u morën në 310 K në një spektrometër Bruker Avance Neo 600 MHz të pajisur me një kriosondë me gradient pulsues QCI me rezonancë katërpolëshe (HFCN).Mostrat NMR që përmbajnë 10 mg/mL proteinë homogjene të etiketuara me 13C, 15N, të tretura në 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Zhvendosjet kimike të NT2RepCT në pH 6.7 u përdorën për të caktuar pikun 23 në spektrin 2D të 15N-HSQC.
Spektrat e ngurtë NMR (MAS) me rrotullim me kënd magjik të hidrogeleve të etiketuara me 13C, 15N u regjistruan në një spektrometër Bruker Avance III HD në 800 MHz të pajisur me një sondë pa elektrone 3,2 mm 13C/15N{1H}.Temperatura e kampionit u kontrollua duke përdorur një rrymë gazi me temperaturë të ndryshueshme në 277 K. Spektrat e rezonancës rrotulluese dypolëshe (DARR) 76 dhe të rilidhjes së frekuencës radio (RFDR) 77 u morën në frekuencat MAS përkatësisht 12,5 kHz dhe 20 kHz.Polarizimi i kryqëzuar (CP) nga 1H në 13C u krye duke përdorur një rampë lineare nga 60.0 në 48.0 kHz në 1H, 61.3/71.6 kHz në 13C (në 12.5/20 kHz MAS) dhe kohë kontakti 0.5-1 ms.Shkëputja Spinal6478 në 73.5 kHz u përdor gjatë mbledhjes së të dhënave.Koha e marrjes ishte 10 milisekonda dhe vonesa e ciklit ishte 2.5 sekonda.Korrelacionet Ca/Cβ me një lidhje të vetme të vëzhguara në spektrat RFDR u caktuan bazuar në zhvendosjet kimike karakteristike të llojit të mbetjeve dhe korrelacionet me shumë lidhje në spektrat DARR.
Baza e të dhënave Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) u përdor për të vlerësuar tendencat e flutterit dhe energjinë e Rosetta-s për NT, NTFlSp dhe NTMiSp.Baza e të dhënave Zipper llogarit Rosetta Energy80, e cila kombinon disa funksione të lirë të energjisë për të modeluar dhe analizuar strukturën e proteinave.Një nivel energjie prej -23 kcal/mol ose më i ulët tregon një tendencë të lartë për të fibriluar.Energjia më e ulët do të thotë më shumë stabilitet të dy fijeve β në konformacionin e zinxhirit.Për më tepër, algoritmi Waltz u përdor për të parashikuar rajonet amiloidogjene në NT, NTFlSp dhe NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Zgjidhja e proteinës NT u përzie me tampon 2-(N-morfolino) acid etanesulfonik (MES) në pH 5.5 dhe 6.0 për të ulur pH në pH 6 dhe 7, respektivisht.Përqendrimi përfundimtar i proteinës ishte 100 mg/ml.
Matjet u kryen në një spektrometër CD J-1500 (JASCO, SHBA) duke përdorur një kuvetë 300 μL me një rrugë optike prej 0,1 cm.Proteinat u holluan në 10 μM (n = 1) në tampon fosfat 20 mM (pH 8).Për të analizuar stabilitetin e proteinave në prani të kripës, proteinat u analizuan në të njëjtin përqendrim (n = 1) në tampon fosfat 20 mM (pH 8) që përmban 154 mM NaF ose NaCl, përkatësisht.Skanimet e temperaturës u regjistruan në 222 nm nga 25°C në 95°C me një shpejtësi ngrohjeje prej 1°C/min.Përqindja e proteinave të palosur në mënyrë vendase u llogarit duke përdorur formulën (KDmasë – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Përveç kësaj, pesë spektra u regjistruan për çdo mostër nga 260 nm në 190 nm në 25 ° C dhe pas ngrohjes në 95 ° C.Pesë spektra u vlerësuan, u zbutën dhe u kthyen në elipticitet molar.Të dhënat u analizuan duke përdorur Prism 9.
Intensiteti i fluoreshencës i His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) u mat në tre kopje (n = 3) në pllaka Corning 96 pusesh me një fund të zi transparent (Corning Glass 3881, USA) në kushte statike.Matni mostrat me një lexues pllakash me bazë fluoreshence me një gjatësi vale ngacmimi prej 395 nm dhe regjistroni emetimin në 509 nm para xhelatimit dhe 2 orë më vonë në 37°C.Të dhënat u analizuan me Prism 9.
Kompleti i analizës së aktivitetit të nukleozid fosforilazës purine (metoda fluorometrike, Sigma Aldrich) është përdorur sipas udhëzimeve të prodhuesit.Për të matur aktivitetin në xhel dhe solucione që përmbajnë His-NT-PNP, përzieni 10 ng His-NT-PNP me 100 mg/mL NT deri në një vëllim total prej 2 µL sepse xheli dha një sinjal mbi intervalin e zbulimit të grupit.U përfshinë kontrolle për xhel dhe solucione pa His-NT-PNP.Matjet u kryen dy herë (n = 2).Pasi u mat aktiviteti, përzierja e reaksionit u hoq dhe xheli u fotografua për të siguruar që xheli të mbetej i paprekur gjatë matjes.Të dhënat u analizuan duke përdorur Prism 9.
Për më shumë informacion mbi hartimin e studimit, shihni abstraktin e studimit të natyrës të lidhur me këtë artikull.
Figura 1 dhe 2 paraqesin të dhënat fillestare.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f dhe 6, Figura plotësuese.3, fig suplementar.5a, d, fig suplementar.6 dhe fig suplementar.8. Të dhënat Të dhënat nga ky studim gjenden në bazën e të dhënave Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Të dhënat NMR të marra në këtë studim u postuan në depo BMRBig nën hyrjen ID bmrbig36.Strukturat e GFP dhe PNP janë marrë nga PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. dhe Johansson, J. Spinning artificial merimang mëndafshi.Kombëtare Kimike.biologjisë.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Gjenomi Nephila clalipes thekson diversitetin e gjeneve të mëndafshit të merimangës dhe shprehjen e tyre komplekse.Genette Kombëtare.49, 895–903 (2017).