Komponenti kimik i tubit të mbështjellë prej çeliku inox 347, Identifikimi i proteinave të reja të leukociteve njerëzore të antigjenit-A (HLA-A) të reagueshme ndaj interferonit duke përdorur spektrometrinë e masës të ndërlidhur (CLMS)

Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Rrëshqitës që tregojnë tre artikuj për rrëshqitje.Përdorni butonat e pasëm dhe të ardhshëm për të lëvizur nëpër rrëshqitje, ose butonat e kontrolluesit të rrëshqitjes në fund për të lëvizur nëpër secilën rrëshqitje.

përshkrim i produktit

Tuba me spirale inox 347L, Klasa e çelikut: SS347L

Sistemi i sinjalizimit të interferonit shkakton një përgjigje të fortë citokine ndaj një game të gjerë sinjalesh patologjike patogjene dhe të brendshme nga mjedisi, duke rezultuar në induksionin e nëngrupeve të proteinave të induktueshme nga interferoni.Ne aplikuam spektrometrinë masive të ndërlidhur të ndërmjetësuar nga DSS (CLMS) për të zbuluar ndërveprimet e reja protein-proteinë në fushën e proteinave të induktuara nga interferoni.Përveç proteinave të pritshme të induktueshme nga interferoni, ne identifikuam gjithashtu addukte të reja ndërmolekulare dhe intramolekulare të ndërlidhura të proteinave kanonike të induktueshme nga interferoni si MX1, USP18, OAS3 dhe STAT1.Ne u fokusuam në vërtetimin ortogonal të një grupi të ri të rrjeteve proteinike të induktueshme nga interferoni të formuara nga proteinat HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) duke përdorur bashkë-imunoprecipitimin dhe studimin e tyre të mëtejshëm duke përdorur modelimin e dinamikës molekulare.Modelimi i dinamikës konformacionale të kompleksit proteinik zbuloi disa vende ndërveprimesh që pasqyronin ndërveprimet e identifikuara në gjetjet e CLMS.Së bashku, ne paraqesim një studim pilot të CLMS për të identifikuar komplekset e reja sinjalizuese të shkaktuara nga interferoni dhe presim me padurim përdorimin më të gjerë të CLMS për të identifikuar dinamikat e reja të ndërveprimeve të proteinave në mikromjedisin e tumorit.
Përpara se të fillojë një përgjigje imune adaptive, sistemi i lindur i mbrojtjes së strehuesit krijon një përgjigje antimikrobiale të ndërmjetësuar nga një familje citokinash alfa-helike të sekretuara të quajtura interferone (IFN).Klasat e tipit I të IFN IFNα dhe IFNβ aktivizojnë përgjigjet qelizore, duke përfshirë gjendjet antivirale, proapoptotike, proinflamatore dhe antiproliferative.Tek njerëzit njihen 13 nëntipe të IFNα, të gjitha të grumbulluara në kromozomin 91. Çuditërisht, vetëm IFNα2 është studiuar për përdorim klinik.Kohët e fundit, vëmendje e veçantë i është kushtuar kërkimit mbi nëntipe të tjera të IFNα.Një studim i fundit tregoi se IFNα14 është një nga izoformat më efektive në kufizimin e replikimit të HBV2 dhe HIV-13,4 në krahasim me nëntipin kanonik IFNα2.
Është vërtetuar se komplekset e aktivizuara të receptorit të interferonit të tipit I (IFNAR1 dhe IFNAR2) shkaktojnë një kaskadë të transduksionit të sinjalit të ndërmjetësuar nga Janus kinases TYK2 dhe JAK15,6.Këto kinaza Janus fosforilojnë transduktorët e sinjalit dhe aktivizuesit e proteinave transkriptuese (STAT1 dhe STAT2) në mbetjet e tirozinës për të filluar heterodimerizimin e ndërmjetësuar nga domeni SH26.Më pas, IRF9 lidh heterodimerët STAT për të formuar një kompleks trimerik të gjenit të faktorit 3 të stimuluar nga IFN (ISGF3), i cili zhvendoset në bërthamë dhe nxit transkriptimin e mbi 2000 gjeneve të stimuluara nga interferoni (ISGs)5,6,7,8.
ISG-të formojnë shtyllën kurrizore të sistemit imunitar të lindur, veçanërisht në përgjigje të sulmit viral.Si linja e parë e mbrojtjes kundër infeksionit viral, qelizat vendosin me shpejtësi ndërveprime të gjera të proteinave qelizore me një gamë të gjerë aktivitetesh biologjike.Këto proteina përfshijnë receptorët e njohjes së modelit, molekulat sinjalizuese, faktorët e transkriptimit dhe proteinat me funksione të drejtpërdrejta antivirale, si dhe rregullatorët negativë të përgjigjeve imune9.Pjesa më e madhe e informacionit mbi aktivitetin e ISG vjen nga ekranet funksionale që përdorin ekranet e mbishprehjes10,11 ose teknikat e heshtjes së gjeneve (siRNA, RNAi dhe CRISPR)12,13 në të cilat ISG-të individuale shprehen ose frenohen dhe aktiviteti i tyre testohet në viruse të ndryshëm.Megjithëse këto studime kanë përcaktuar vetitë antivirale të ISG-ve individuale, mekanizmat themelorë molekularë të secilit ISG mbeten kryesisht të panjohur.Në përgjithësi pranohet që shumë proteina ndërveprojnë me një ose më shumë citokina për të siguruar aktivitet të plotë, kështu që ose ISG-të ndërveprojnë drejtpërdrejt ose ndërveprimet e tyre ndërmjetësohen nga proteinat qelizore.Për shembull, një studim i kohëve të fundit i proteomikës së ndërlidhur me fotokryq identifikoi ATPase VCP/p97 si një partner kryesor i ndërveprimit IFITM3, frenimi i të cilit çon në defekte në klasifikimin lizozomal, qarkullimin dhe bashkëtransportin e IFITM3 me grimcat virale 14 .Duke përdorur imunoprecipitimin, ne identifikuam VAPA, një proteinë e lidhur me vezikulat, si një partner ndërveprimi me IFITM1/2/3 që ndërmjetëson maturimin viral të ndërmjetësuar nga kolesteroli dhe kjo u konfirmua nga një studim tjetër duke përdorur një sistem dy hibrid maja.Mbështetja shkencore 15, 16.
Një proces themelor biologjik i përfshirë në shtypjen e infeksionit dhe transformimit malinj është prezantimi i antigjenit, i cili ndërmjetësohet nga molekulat kryesore të kompleksit të histokompatibilitetit (MHC).Peptidet (8-12 aminoacide të gjata) nga proteinat e shkëputura, të ndërprera para kohe ose të palosura gabimisht ngarkohen në heterodimerin MHC-I (i përbërë nga zinxhirë të rëndë dhe të lehtë MHC-I, të quajtur β-2-mikroglobulina; β2M) 17,18.Trimerët e qëndrueshëm MHC-I që rezultojnë transportohen në sipërfaqen e qelizës, ku paraqesin peptide ndërqelizore në qelizat T CD8+ (qelizat T citotoksike)17.Qelizat T njohin dhe shkatërrojnë këta patogjenë dhe qeliza që mbartin një antigjen specifik për tumorin.Rrjedhimisht, patogjenët dhe qelizat tumorale shpesh shtypin procesin e paraqitjes së antigjenit për të shmangur mbikëqyrjen imune.Për më tepër, MHC-I është ulur poshtë në 40-90% të tumoreve njerëzore dhe shpesh shoqërohet me një prognozë më të dobët19.
Gjenet e përfshira në reagimin ndaj patogjenëve duhet të kalojnë shpejt ndërmjet gjendjes së pushimit dhe gjendjes së transkriptimit aktiv.Prandaj, disa proteina qelizore supozohet se përfshihen në përgjigjen ndaj kërkesës së lartë për IFN për periudha të shkurtra kohore, duke përfshirë rimodelimin dhe modifikimin e kromatinës promotore 20,21.Shumica e studimeve janë fokusuar në identifikimin e partnerëve individualë të proteinave ISG në prani të IFN.Disa studime proteomike dhe transkriptomike në sistemet e qelizave model kanë sqaruar efektin e IFN në peizazhin qelizor.Megjithatë, pavarësisht nga një kuptim në rritje i dinamikës së shkaktuar nga interferonet, ne ende dimë pak për përfshirjen e ISG-ve.Kur merret parasysh kompleksiteti dhe dinamika e varur nga koha e sinjalizimit të interferonit, lindin dy pyetje: (i) a është e mundur të stabilizohen dhe bllokohen komplekset multiproteinike të përfshira në sinjalizimin e shpejtë, dhe (ii) a mund të hartohen këto ndërveprime në hapësirën 3D?
Për të adresuar këto çështje, ne zbatuam ndërlidhjen kimike të ndërmjetësuar nga suberate disukcinimide (DSS) së bashku me spektrometrinë e masës (CLMS) për të studiuar rrjetin e ndërveprimit të proteinave të induktuar nga IFNα dhe dinamikën e tij.DSS shton lidhje kovalente midis mbetjeve proksimale të proteinave dhe/ose komplekseve proteinike in vivo.Analiza e mëvonshme e MS zbulon vende specifike ndërlidhjeje që pasqyrojnë afërsinë hapësinore të rajoneve brenda një proteine ​​të caktuar, të quajtura lidhje të brendshme, ose nën-njësi në komplekset e proteinave, të quajtura ndërlidhje.Duke përdorur këtë qasje, ne kemi identifikuar disa komplekse të reja proteine-proteinike, si dhe rrjete ndërveprimesh multiproteinike të induktuara nga interferoni.Duke testuar më tej një nëngrup të këtyre ndërveprimeve të reja, ne demonstrojmë se H2BFS (FS e tipit H2B histone; më poshtë referuar si H2B) dhe MDN1 veprojnë si partnerë lidhës për HLA-A.
Qelizat Flo-1 janë një nga modelet më të njohura in vitro të adenokarcinomës së ezofagut pasi ato imitojnë tiparet kryesore të tumoreve të ezofagut22,23.Megjithatë, jo të gjithë tumoret janë imunogjenë dhe për të përcaktuar nëse qelizat Flo-1 i përgjigjen trajtimit me interferon, ne trajtuam qelizat Flo-1 me 10 ng/ml IFNα për 72 orë.Qelizat Flo-1 treguan induksion të hershëm të pSTAT1 dhe IRF1, duke filluar 2 orë pas trajtimit dhe duke vazhduar për 72 orë, me një ulje të varur nga koha në nivelet stacionare të IRF1 (Figura 1A).ISG-të (MX1, IFITM1, OAS1/2 dhe ISG15) u zbuluan se induktohen fuqishëm pas 6 orësh, duke imituar përgjigjet klasike të fazës së mesme dhe të vonë ndaj IFNα (Figura 1A).Së bashku, këto të dhëna sugjerojnë se ky model qelizor mund të përdoret për të studiuar përgjigjet e interferonit.
Përgjigjet e shprehjes diferenciale të proteinave në qelizat Flo-1 pas trajtimit me IFNα.(A) Shprehja e proteinave në qelizat Flo-1 të trajtuara me 10 ng/ml IFNα për 2, 6, 24, 48 dhe 72 orë u analizua me imunoblot duke përdorur antitrupat e treguar ISG.(B) Xhel SDS-PAGE të ngjyrosur me Coomassie blu të ekstrakteve të qelizave të plota pas ndërlidhjes me DSS për kohët dhe përqendrimet e treguara.(C) Imunobloti përfaqësues i ekzaminuar me antitrup p53(DO-1) nga të njëjtat mostra për të vlerësuar shkallën e ndërlidhjes së proteinave.
Për të kapur peizazhin e ndërveprimit të proteinave në vend, ne përdorëm DSS, një agjent ndërlidhës i përdorur gjerësisht për shkak të përshkueshmërisë së lartë të membranës dhe kohës relativisht të shkurtër të reagimit.Koha më e shkurtër e reagimit ndihmon në parandalimin e formimit të agregateve të mëdha të proteinave të ndërlidhura, duke ruajtur kështu stabilitetin e ndërlidhësit.Për të përcaktuar përqendrimin optimal të DSS dhe për të shmangur lidhjet e tepërta, së pari i ekspozuam qelizat në 5, 2.5 dhe 1 mM DSS për 5, 10, 5 dhe 30 minuta, përkatësisht, dhe analizuam lizatet me SDS-PAGE të ngjyrosur me Coomassie. (të dhënat nuk tregohen) .Lizatet e qelizave duket se janë shumë të ndërlidhura në përqendrimin më të ulët dhe në momentin më të shkurtër kohor.Prandaj, DSS u titrua në 1, 0.5 dhe 0.1 mM gjatë 5 minutave (Figura 1B).Lidhja e kryqëzuar optimale u vu re me 0.5 mM DSS për 5 minuta dhe këto kushte u zgjodhën për qelizat e trajtuara me IFNα.Përveç kësaj, Figura 1C tregon një blot Western të kryer duke përdorur antitrupin p53 (DO-1) për të vlerësuar shkallën e ndërlidhjes së proteinave.
Qelizat Flo-1 u trajtuan me 10 ng/ml IFNα për 24 orë përpara se të shtohej ndërlidhësi.Qelizat e ndërlidhura u lizuan më pas nga proteoliza me dy hapa dhe proteinat u përpunuan nga FASP (Fig. 2) 24,25.Peptidet triptike të ndërlidhura u analizuan me spektrometrinë e masës (Fig. 2).Spektrat MS/MS më pas përputhen me sekuencën e proteinave dhe përcaktohen në sasi me MaxQuant26,27.Peptidet e ndërlidhura u identifikuan nga spektri i marrë duke përdorur programin SIM-XL dhe komponimet individuale u kombinuan në një rrjet kompleks duke përdorur tubacionet e programeve kompjuterike me burim të hapur xQuest28 dhe SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifikon ndërveprimet protein-proteinë, zinxhirët e brendshëm dhe zinxhirët individualë në përzierjet e thjeshta ose komplekse të proteinave dhe ofron skripta për vizualizimin e ndërveprimeve në strukturat e proteinave.Për më tepër, ai rendit çdo referencë të kryqëzuar si një rezultat ID sipas cilësisë së spektrit MS/MS29.Janë identifikuar disa ndërveprime dhe komplekse protein-proteinë shumë të besueshme dhe një grup i ri ndërveprimesh është hetuar më tej duke përdorur bashkë-imunoprecipitimin dhe ndryshimet konformacionale të komplekseve duke përdorur modelimin e dinamikës molekulare (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Pasqyrë skematike e metodës CLMS.Qelizat Flo-1 u trajtuan me 10 ng/ml IFNα për 24 orë e ndjekur nga ndërlidhja e proteinave in situ duke përdorur DSS e ndjekur nga liza e qelizave dhe tripsinizimi.Mostrat e ndërlidhura u analizuan duke përdorur një spektrometër masiv Orbitrap dhe më tej u morën kampione për fragmentimin e prekursorëve peptidë gjatë LC-MS/MS.Dy peptide të lidhura u identifikuan nga spektri i marrë duke përdorur makinën e njohjes së spektrit të programit të Peptideve të ndërlidhura (SIM-XL) dhe të gjitha komponimet u kombinuan në një rrjet kompleks duke përdorur tubacione llogaritëse.Filtro ndërveprimet me besim të ulët bazuar në rezultatet e normës false pozitive (FDR).Disa ndërveprime të reja protein-proteinë me besnikëri të lartë u konfirmuan më tej duke përdorur bashkë-imunoprecipitimin dhe ndryshimet konformacionale në komplekse u ekzaminuan duke përdorur modelimin e dinamikës molekulare (MD).
Një total prej ~ 30,500 dhe ~ 28,500 peptide u zbuluan duke përdorur MaxQuant në mostrat IFNα të pastimuluara dhe të stimuluara, përkatësisht (Tabela S1 plotësuese, Fig. 3A).Shpërndarja e gjatësisë së peptideve në të dyja rastet tregoi një proporcion më të lartë të peptideve më të mëdhenj, duke treguar praninë e peptideve të ndërlidhura (Fig. 3B, C).Përveç kësaj, një pjesë më e madhe e peptideve më të mëdha ishin të pranishme në rangun 40-55 në mostrat e trajtuara me IFNα (Fig. 3C).Harta e proteinave kundrejt intensitetit log2 tregoi se proteinat klasike të stimuluara nga interferoni ishin më të bollshmet në krahasim me mostrat e patrajtuara, duke përfshirë MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 dhe HLA-F (Figura 3D).Analiza e rrugëve për proteinat më shumë se trefish të pasuruara në përgjigje të trajtimit IFNα duke përdorur bazën e të dhënave të rrugës Reactome tregoi se prezantimi dhe përpunimi i antigjenit i ndërmjetësuar nga MHC-I ishte rruga më dominuese (Figura 3E).Në përputhje me raportet e mëparshme, përgjigjet antivirale të ndërmjetësuara nga OAS dhe ISG15, si dhe sinjalizimi i IFNα/β dhe citokinës ishin ndër rrugët e aktivizuara.Për më tepër, lidhjet e kryqëzuara të proteinave specifike të lizinës dhe serinës u identifikuan nga spektri i fituar fillimisht MS/MS duke përdorur SIM-XL.Një studim i fundit raportoi 104 ISG që përfshinin 20 viruse nga 9 klasa virusesh me meta-analizë të studimeve individuale të mbishprehjes së ISG në 5 lloje qelizash9.Megjithatë, për të kapërcyer kufizimet llogaritëse të shqyrtimit të grupeve të të dhënave të mëdha, ne filluam me një grup të dhënash më të vogël për të eksploruar ndërveprimet e mundshme midis listës së gjeneve IRDS të raportuara nga Padaria et al., shumica e të cilave janë ISG.
Identifikimi i proteinave të ndërlidhura të shprehura diferenciale në përgjigje të IFNα (të dhënat e marra nga MaxQuant).(A) Diagrami i Venit që përfaqëson numrin e peptideve të zakonshme dhe ekskluzive të identifikuara në mostrat Flo-1 të trajtuara dhe të patrajtuara me IFNα14.Shpërndarja e gjatësisë së peptideve të mostrave të patrajtuara (B) dhe të trajtuara me IFNα (C) të ndërlidhura.(D) Harta e nxehtësisë që përfaqëson log2 (intensiteti LFQ) midis qelizave Flo-1 të patrajtuara dhe të trajtuara me IFNα14.Paneli i majtë tregon proteinat që aktivizohen në mënyrë më aktive në prani të IFNα.(E) Histograma që përfaqëson 20 rrugët kryesore të pasurimit pas trajtimit me IFNα.Baza e të dhënave të rrugës Reactome analizoi më shumë se katërfish ndryshime në proteinat e rregulluara të përgjegjshme ndaj IFNα.
Stimulimi i ISG i ndërmjetësuar nga interferoni është i dokumentuar mirë, por në nivel molekular nuk kuptohet mirë se si këto proteina arrijnë kulmin në një gamë të gjerë funksionesh biologjike.Ne hetuam ndërveprimet e proteinave me një shkallë të lartë besimi midis ISG-ve të njohura.Interesante, ne identifikuam një rrjet që përfshin proteinat MX1, USP18, ROBO1, OAS3 dhe STAT1 që formojnë një kompleks të madh në përgjigje të trajtimit me IFNα (Figura 4, Tabela S2) 32,33,34.Më e rëndësishmja, këto ndërveprime u gjetën në të gjitha trefishat e trajtuara me IFNα dhe nuk u gjetën në mostrat e patrajtuara, duke sugjeruar se ato u formuan në mënyrë specifike në përgjigje të trajtimit me IFNα.Dihet që STAT1 rregullon në mënyrë transkriptuese shprehjen e këtyre ISG-ve, por ndërveprimi i tij me ISG-të në nivel proteinash nuk është studiuar.Struktura kristalore e STAT1 tregoi se domeni i tij spirale (CCD) nuk është i përfshirë në ndërveprimin me ADN-në ose protomerët gjatë formimit të dimereve35.Këto α-spira formojnë një strukturë spirale spirale që siguron një sipërfaqe kryesisht hidrofile për ndërveprimet që ndodhin 35 .Në të dhënat tona CLMS, ne vumë re se shumica e ndërveprimeve me STAT1 ndodhën në domenin SH2 që i paraprin CCD, domenit lidhës ose bishtit të terminalit C (mbetjet 700-708) (Figura 4A).Një studim i mëparshëm raportoi se USP18 lidhet me CCD dhe domenin lidhës me ADN-në (DBD) të STAT2 dhe rekrutohet në nën-njësinë e receptorit të interferonit të tipit I IFNAR2 për të ndërmjetësuar frenimin e sinjalizimit të interferonit të tipit I 24 .Të dhënat tona treguan gjithashtu se domeni katalitik USP18 ndërvepron me STAT1 DBD (Figura 4A, D), duke sugjeruar që të dy STAT1 dhe STAT2 mund të luajnë një rol në tërheqjen e USP18 në IFNAR2.
Rrjeti ISG protein-proteinë i identifikuar në qelizat e ndërlidhura të trajtuara me IFNα.(A) Grafiku i ndërveprimit 2D që tregon ndërveprimet protein-proteinë (të krijuara në programin SIM-XL), me linja që përfaqësojnë ndërveprimet ndërmolekulare (ndërprerja e lidhjeve të kryqëzuara është vendosur në 3.5).Domenet e identiteteve të ndryshme shënohen me ngjyrën e tyre32: domeni MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) dhe GED (569–660).Domenet OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) dhe OAS1_C (903-108).Domeni ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) dhe fn3 (777–864).Fushat STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alfa (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) dhe STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Shikuesi rrethor i proteinave të ndërlidhura (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 dhe STAT1) me ndërveprime dhe ndërveprime të etiketuara përkatësisht me ngjyrë blu dhe të kuqe.Pragu i ndërlidhjes u caktua në 3.5.Grafikët me pika tregojnë vendet e ndërveprimit STAT1 me MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) dhe OAS3 (F), si dhe vendet e ndërveprimit K ose S midis dy peptideve.Në figurë, pragu i rezultatit të ndërlidhjes është vendosur në 3.0.(G) Vende të ndryshme ndërveprimi midis domeneve STAT1 dhe OAS3 DI të mbivendosura në strukturat e tyre proteinike në PyMol (sistemi grafik molekular PyMOL, versioni 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (idb pdb: 1bf533) dhe OAS3 (idb pdb: 4s3n34).) program.
Dy izoforma të USP18 janë përshkruar tek njerëzit, një proteinë me gjatësi të plotë që ndodhet kryesisht në bërthamë dhe një izoformë pa një domen N-terminal, USP18-sf, e cila shpërndahet në mënyrë të barabartë në citoplazmë dhe bërthamë 36 .Për më tepër, fundi-N u parashikua të ishte i pastrukturuar dhe nuk kërkon aktivitet izopeptidase ose lidhje ISG1537.Shumica e ndërveprimeve të identifikuara në studimin tonë u vendosën në skajin N të proteinës, duke sugjeruar që këto ndërveprime përfshijnë USP18 me gjatësi të plotë (Figura 4A, D) dhe kështu ka të ngjarë të ndodhin në bërthamë.Për më tepër, të dhënat tona tregojnë gjithashtu se terminali N është i specializuar për ndërveprimet protein-proteinë.Vendi i lidhjes së IFNAR2 ndodhet midis mbetjeve 312-368, dhe veçanërisht, asnjë nga proteinat në kompleks nuk lidhet me këtë rajon (Fig. 4A) 37,38.Këto të dhëna të marra së bashku tregojnë se domeni lidhës IFNAR2 përdoret ekskluzivisht nga proteina e receptorit.Për më tepër, vetëm OAS3 dhe ROBO1 u gjetën të lidhur me domenet në rrjedhën e sipërme të vendit të lidhjes N-terminus dhe IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 i përket superfamiljes së imunoglobulinave (Ig) të molekulave sinjalizuese transmembranore dhe përbëhet nga pesë domene Ig dhe tre domene të fibronektinës (Fn) në rajonin jashtëqelizor.Këto domene jashtëqelizore ndiqen nga një rajon membranor-proksimal dhe një spirale e vetme transmembranore 39. Një rajon intraqelizor i pastrukturuar ndodhet në fundin C dhe përmban motive të sekuencës së konservuar që ndërmjetësojnë lidhjen e proteinave efektore39.Rajoni që shtrihet nga aminoacide ~1100 deri në 1600 është kryesisht i çrregulluar.Ne zbuluam se MX1 ndërvepron me ROBO1 përmes Ig, Fn dhe domeneve ndërqelizore, ndërsa shumica e ndërveprimeve me STAT1 ndodhin midis CCD-së së tij, domenit lidhës dhe C-fundit të ROBO1 (Fig. 4A, E).Nga ana tjetër, ndërveprimet me rajonet lidhëse DI, DIII dhe OAS3 u shpërndanë në të gjithë proteinën ROBO1 (Fig. 4A).
Familja e proteinave oligoadenilate sintaza (OAS) pranon dhe lidh ARN me dy vargje ndërqelizore (dsARN), pëson ndryshime konformacionale dhe sintetizon oligoadenilate të lidhura me 2',5' (2-5 As) 40 .U zbulua se midis tre OAS-ve, OAS3 shfaq afinitetin më të lartë për dsRNA dhe sintetizon sasinë më të vogël të 2-5 As, e cila mund të aktivizojë RNase L dhe në këtë mënyrë të kufizojë replikimin viral 41 .Familja OAS përbëhet nga domenet e transferazës së nukleotideve të ngjashme me polimerazën beta (pol-β).Hulumtimet e mëparshme kanë treguar se aktiviteti katalitik i domenit C-terminal (DIII) është i varur nga domeni i lidhjes së dsRNA (DI), i cili kërkohet për aktivizimin e OAS342.Ne vumë re se domenet DI dhe DII të OAS3 ndërveprojnë me CCD dhe një rajon të vogël kryqëzimi midis SH2 dhe STAT1 TAD (Figura 4A, F).Mbivendosja e vendeve të ndryshme të ndërlidhjes në strukturën e proteinës zbuloi një ndërveprim midis fletës β dhe lakit DBD STAT1 dhe një xhepi të hapur ose zgavër të formuar nga mbetjet 60-75 në domenin DI të OAS3 (Fig. 4G).Orientimi i proteinave në kompleks tregoi gjithashtu se asnjë nga ndërveprimet me OAS3 nuk ndërhyri në aftësinë e lidhjes së ADN-së të domenit të tij DI (Fig. S1A).Përveç kësaj, domeni N-terminal i GTPase MX1 ndërvepron gjerësisht me domenet DI dhe DIII të OAS3 (Fig. 4A).Ne vëzhguam gjithashtu një ndërveprim midis OAS1 dhe MX1 në të tre përsëritjet e trajtuara me IFNα, ku një domen i vetëm OAS1 (gjithashtu aktiv katalitik) ndërveproi me të tre domenet MX1 (Figura S2A, B).
Proteinat MX janë pjesë e një familjeje të madhe të GTPase-ve të ngjashme me dyneinën që përmbajnë një domen GTPase N-terminal që lidh dhe hidrolizon GTP, një domen të ndërmjetëm që ndërmjetëson vetë-montimin dhe një zinxhir leucine C-terminal që vepron si një GTPazë (LZ ).domeni efektor i domenit25,43.MX1 lidhet me nënnjësitë e polimerazave virale për të bllokuar transkriptimin e gjenit viral43.Një ekran i raportuar më parë me dy hibride maja tregoi se MX1 i lidhur me PIAS1 pengon aktivizimin e gjenit të ndërmjetësuar nga STAT1 duke bllokuar aktivitetin e lidhjes së ADN-së dhe gjithashtu ka aktivitet ligaze SUMO E344,45.Këtu, ne demonstrojmë se MX1 lidhet me STAT1 (Figura 4C, D), megjithatë se si ky ndërveprim ndikon në aktivizimin e gjenit të ndërmjetësuar nga STAT1 në përgjigje të IFNα, ka nevojë për studim të mëtejshëm.Përveç kësaj, ne zbuluam gjithashtu se MX1 ndërveproi me IFIT3 dhe DDX60 në të tre përsëritjet e trajtuara me IFNα (Fig. S2C).
DDX60 është një helikazë citoplazmike e induktuar nga IFN që është raportuar më parë se luan një rol në degradimin e pavarur nga RIG-I të ARN46 virale.Ai ndërvepron me RIG-I dhe aktivizon sinjalizimin e tij në një mënyrë specifike për ligand 46. DDX60 përbëhet nga një domen helikaze DEXD/H-Box dhe një domen helikazë C-terminal që lidh ARN virale dhe ADN47.Shumica e ndërveprimeve të tij me MX1 dhe IFIT3 ndodhin brenda rajoneve të gjata N- dhe C-terminale pa domene ose motive kanonike (Fig. S2E,F).Megjithatë, MX1 shoqërohet gjithashtu me domenin helikazë DEXD/H-Box (Fig. S2E).Proteinat e familjes IFIT kanë kopje të njëpasnjëshme të një motivi të veçantë spirale-kthesë-helix të quajtur përsëritja tetrapeptide (TPR).IFIT3 u zbulua se ishte një modulator pozitiv i sinjalizimit RIG-I dhe si rrjedhim një komponent i kompleksit MAVS.Të marra së bashku, të dhënat tona sugjerojnë se IFIT3 dhe DDX60 ndërveprojnë kryesisht në rajonin midis TPR 3-6 të IFIT3 dhe mund të luajnë një rol në sinjalizimin RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Duke pasur parasysh se shqyrtimi i të gjithë proteomës është intensiv nga pikëpamja llogaritëse, ne më pas kontrolluam të gjithë bazën e të dhënave njerëzore UniProt për praninë e një prej përsëritjeve të trajtuara me IFNα.Në këtë kopje, ne gjetëm disa rrjete ndërveprimi shumë të besueshme për HLA-A.Analiza e rrugëve të proteinave të identifikuara nga spektri MS/MS tregoi se përpunimi dhe prezantimi i antigjenit me bazë MHC-I është rruga kryesore e induktuar nga interferoni (Fig. 3D).Prandaj, ne u fokusuam në studimin e ndërveprimeve proteinike të molekulave MHC-I me një shkallë të lartë besimi në të gjitha mostrat e ndërlidhura.HLA përbëhet nga domenet α1, α2 dhe α3 dhe zinxhirët e lehtë, dhe mikroglobulina β2 (β2m) është një proteinë e vazhdueshme përcjellëse49.Pasi montohet në rrjetin endoplazmatik, HLA është i paqëndrueshëm në mungesë të ligandeve peptide50.Brazda e lidhjes me peptidet formohet nga domenet α1 dhe α2 shumë polimorfike dhe të pastrukturuara në formë jo peptide dhe nga domeni α351 relativisht më pak polimorfik.Në prani të IFNα, ne zbuluam dy komplekse HLA-A: njëri ndërvepron me HMGA1 dhe H2B (Figura 5, Tabela S3) dhe tjetri ndërvepron me MDN1, LRCH4 dhe H2B (Figura 6).
IFNα indukton një rrjet ndërveprimi HLA-A me H2B (H2BFS) dhe HMGA1.(A) Grafik 2D (i gjeneruar në softuerin SIM-XL) që përshkruan lloje të ndryshme ndërveprimesh në kompleksin H2B-HLA-A-HMGA1: ndërlidhje (blu), ndërlidhje (e kuqe) dhe lidhje e vetme (e zezë)..Domenet e identiteteve të ndryshme janë të koduara me ngjyra32: H2B (histone; 2-102) dhe MHC-I (MHC_1; 25-203, grupi C1; 210-290 dhe MHC_I_C; 337-364).Pragu i ndërlidhjes u caktua në 3.5.Grafikët me pika tregojnë vendet e ndërveprimit HLA-A me H2B (B) dhe HMGA1 (C), si dhe vendet e ndërveprimit K ose S midis dy peptideve.Në figurë, pragu i rezultatit të ndërlidhjes është vendosur në 3.0.(D) Marrëdhëniet midis proteinave të treguara në strukturat e proteinave H2B, HLA-A dhe HMGA1 në programin PyMOL.Këto struktura u modeluan duke përdorur serverin Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) dhe strukturat model për proteinat H2B, HLA-A dhe HMGA1 ishin përkatësisht 1kx552, 1kj349 dhe 2eze55.
IFNα indukton një rrjet ndërveprimi HLA-A me H2B (H2BFS), MDN1 dhe LRCH4.(A) Lidhjet ndërmolekulare (të kuqe) dhe ndërmolekulare (blu) të paraqitura në një hartë ndërvepruese 2D (të gjeneruar në softuerin SIM-XL) me MDN1 të përfaqësuar si një rreth.Pragu i ndërlidhjes u caktua në 3.5.Domenet e identiteteve të ndryshme janë të koduara me ngjyra32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupi C1; 210–290 dhe MHC_I_C; 337–364) dhe LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) dhe CH (535-641)).(B) Marrëdhëniet midis proteinave të treguara në strukturat e proteinave H2B, HLA-A, LRCH4 dhe MDN1 në programin PyMOL.Këto struktura u modeluan duke përdorur serverin Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) me struktura shabllone 1kx552, 1kj349, 6hlu62 dhe 6i2665 për proteinat H2B, HLA-A, LRCH4 dhe MDN1, përkatësisht.Vizatimet me pika që tregojnë vendet e ndërveprimit K ose S për HLA-A me H2B (C), LRCH4 (D) dhe MDN1 (E).Për parcelat, pragu i rezultatit të ndërlidhjes u caktua në 3.0.
Përveç ruajtjes së integritetit të gjenomit, histoni H2B është i përfshirë edhe në rregullimin e transkriptimit.Proteina H2B përbëhet nga një domen qendror i histonit (HFD) i formuar nga tre α-spira të ndara nga sythe dhe një bisht C-terminal 41,52.Pjesa më e madhe e ndërveprimit me H2B ndodh në spiralen α1, e cila siguron trimerizim me heterodimerin HFD (Fig. 5A,B).Megjithëse lizinat janë të përfshira në lidhjen e ADN-së, disa lizina janë gjithashtu vende alternative të acetilimit ose metilimit.Për shembull, mbetjet K43, K46 dhe K57 nga H2B nuk janë të përfshira në lidhjen e drejtpërdrejtë të ADN-së, por janë objektiva të modifikimeve të ndryshme pas transkriptimit53.Në mënyrë të ngjashme, mbetjet K44, K47 dhe K57 në H2B mund të luajnë një rol alternativ në praninë e IFNα, duke përfshirë ndërveprimet me proteinat e tjera (Fig. 5A, B).Përveç kësaj, histoni ekstrakromozomal H2B aktivizon përgjigjen imune në lloje të ndryshme qelizash, duke vepruar si një sensor citosolik për të zbuluar fragmente të ADN-së me dy zinxhirë (dsDNA) që rrjedhin nga agjentë infektivë ose qeliza të dëmtuara54.Në prani të viruseve të ADN-së, pakësimi i H2B pengoi prodhimin e IFN-β dhe fosforilimin STAT154.Dihet gjithashtu se H2B lëviz brenda dhe jashtë bërthamës më shpejt se histonet e tjera bërthamore54.Ndërveprimet H2B me MDN1 dhe LRCH4 u vunë re gjithashtu në mostrat e përzgjedhura të patrajtuara.Ne zbuluam se HLA-A ndërveproi me H2B në të tre mostrat e trajtuara me IFNα dhe në një kampion të përsëritur të patrajtuar.Këto të dhëna pasqyrojnë rolin e H2B në një funksion fiziologjik alternativ të pavarur nga rregullimi transkriptues.
HMGA1 (grupi me lëvizshmëri të lartë AT-Hook 1), një nukleoproteinë e vogël e pasur me aminoacide që nxisin sëmundjen, është identifikuar në lidhje me HLA-A.Ai ka një bisht acid C-terminal dhe tre DBD të dallueshme të quajtura grepa AT sepse ato lidhen me brazdë të vogël të rajonit të pasur me AT në dsDNA55,56.Kjo lidhje bën që ADN-ja të përkulet ose drejtohet, duke lejuar faktorët kanonikë të transkriptimit të aksesojnë sekuencën e saj konsensus.Bishti C-terminal besohet të jetë i përfshirë në ndërveprimet protein-proteinë dhe në rekrutimin e faktorëve të transkriptimit, pasi mutantët e fshirjes së C-terminalit nuk janë në gjendje të fillojnë transkriptimin57.Për më tepër, ky domen përmban disa vende të konservuara fosforilimi që janë substrate të njohura për kinazat 58 .Ne vëzhguam ndërveprimet HLA-A dhe H2B me HMGA1 jashtë domenit C-terminal, duke sugjeruar që domeni C-terminal përdoret kryesisht për lidhjen e faktorit të transkriptimit (Fig. 5A, C).Proteinat HMGA konkurrojnë me histonin H1 për t'u lidhur me ADN-në e përshtatësit, duke rritur kështu aksesin57.Në mënyrë të ngjashme, duket e mundshme që HMGA ndërvepron me histonin H2B përgjatë ADN-së lidhëse në konkurrencë me histonin H1.HMGB1 nxit shprehjen e HLA-A, -B dhe -C në qelizat dendritike, duke çuar në aktivizimin e tyre59, por një ndërveprim midis HMG dhe HLA nuk është raportuar më parë.Ne zbuluam se HMGA1 ndërvepron me domenet α1 dhe α3 të HLA-A, me shumicën e ndërveprimeve jashtë 3 DBD të tij (Figura 5A, C).Në duart tona, HLA-A u zbulua se ishte i lokalizuar në bërthamë (të dhënat nuk tregohen), dhe duke pasur parasysh se H2B dhe HMGA1 janë gjithashtu të pranishëm në bërthamë, ky ndërveprim ka të ngjarë të ndodhë në bërthamë.Adduktet specifike të matura midis H2B, HLA-A dhe HMGA1 janë paraqitur në Figurën 5D.
Shumica e ndërveprimeve të HLA-A me proteinat e tjera ndodhin brenda domeneve të tij α1 dhe α2 dhe domenit C-terminal të çrregullt (Fig. 6).Në një nga këta shembuj, ne zbuluam se HLA-A ndërvepron me bishtin e çrregullt N-terminal të LRCH4 (Figura 6A,D).LRCH4 rregullon aktivizimin e TLR4 dhe induksionin e citokinës LPS, duke moduluar kështu përgjigjen e lindur imune60,61.Është një proteinë membranore me nëntë përsëritje të pasura me leucinë (LRRs) dhe një motiv homologjik kalmodulin (CH) në ektodominën e saj, e ndjekur nga një domen transmembranor (TMD) 60, 62.Domenet CH janë raportuar se ndërmjetësojnë ndërveprimet protein-proteinë 60 .Një shtrirje prej rreth 300 aminoacide midis domeneve LRR dhe CH është relativisht e aksesueshme, por e çrregullt.Bazuar në funksionin e rajoneve të çrregullta si ndërmjetës të rrjeteve protein-proteinë dhe transportit vezikular 63, ne zbuluam se shumica e ndërveprimeve proteinike ndodhin në rajone të çrregullta.Ndërveprimet me MDN1 u shpërndanë përgjatë gjatësisë së proteinës, duke përfshirë domenet LRR1, LRR6, CH dhe rajonet e rastësishme, ndërsa H2B lidhet kryesisht me domenin CH (Fig. 6A, B).Veçanërisht, asnjë nga ndërveprimet nuk përfshinte TMJ, duke sugjeruar specifikën e qasjes CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 është identifikuar gjithashtu si pjesë e rrjetit të proteinave HLA-A (Figura 6A).I përket familjes së proteinave AAA (ATPaza të lidhura me aktivitete të ndryshme).Ky është i njëjti domen N-terminal AAA që organizohet në një unazë heksamerike dhe heq faktorin e montimit nga nën-njësia ribozomale 60S 64.duket të jetë e ngjashme me dynein64,65,66.Përveç kësaj, rajoni i pasur me Asp/Glu ndiqet nga domeni MIDAS (vend i varur nga jonet metalike).Për shkak të madhësisë së madhe të MDN1 (afërsisht 5600 aminoacide) dhe homologjisë së tij të kufizuar me proteinat e studiuara mirë, dihet pak për strukturën dhe funksionin e tij tek njerëzit.Ne identifikuam HLA-A, H2B dhe LRCH4 si partnerë lidhës të MDN1 dhe zbuluam orientimin e tyre si komplekse proteinash në PyMol (Fig. 6A, B).Këto tre proteina ndërveprojnë me domenin AAA, domenin lidhës të ngjashëm me dynein dhe ndoshta domenin MIDAS MDN1.Në një raport të mëparshëm, pastrimi i afinitetit të proteinave të karremit identifikoi MDN1 si një proteinë të lidhur me histone H2B67.Përveç kësaj, një studim i fundit raportoi gjithashtu një ndërveprim midis MDN dhe HLA-B në qelizat HCT116 duke përdorur spektrometrinë e masës të pastruar me afinitet, duke mbështetur gjetjet tona68.Identifikimi i këtij kompleksi në mostrat e trajtuara me IFNα sugjeron një rol të MDN1 në sinjalizimin e interferonit.
Për shkak se gjenet HLA janë shumë polimorfike, ne kemi nxjerrë leximet e sekuencës duke hartuar HLA-A, -B dhe -C nga të dhënat e sekuencës së ARN-së të qelizave Flo-1 (të dhënat nuk tregohen).Sekuencat e peptideve në përputhje me leximin e sekuencës zbuluan dallime domethënëse midis HLA-A, -B dhe -C në rajonet ku peptidet e ndërlidhura ndodheshin në HLA-A (Figura S3).Përveç kësaj, ne nuk kemi vërejtur lidhjen e kryqëzuar protein-proteinë të molekulave HLA-B/C me proteinat H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Kjo sugjeron që ndërveprimi i proteinave i gjetur midis HLA-A, MDN1, LRCH1 dhe HMGA1 është specifik për HLA-A.Përveç kësaj, analiza proteomike e mostrave jo të ndërlidhura (Tabela S4) tregoi se HLA-A ka mbulim më të lartë të sekuencës në krahasim me HLA-B ose HLA-C.Peptidet e identifikuara për HLA-A ishin me intensitet të lartë si në mostrat e trajtuara me IFNα ashtu edhe në ato të patrajtuara.
Për të siguruar që ndërveprimet e identifikuara këtu nuk ishin për shkak të ndërlidhjes jo-specifike të dy proteinave në afërsi hapësinore, ne konfirmuam më tej dy faktorë të rinj ndërveprues HLA-A duke kryer analiza të bashkë-imunoprecipitimit.Ndërveprimet HLA-A me MDN1 dhe H2B endogjene u zbuluan në qelizat Flo-1 të trajtuara me IFNα dhe të patrajtuara (Figura 7, Figura S4).Ne konfirmuam se HLA-A u kap nga H2B në imunoprecipitat dhe se kjo lidhje ishte për shkak të trajtimit IFNα pasi HLA-A mungonte në mostrat imunoprecipitate nga qelizat e patrajtuara (Figura 7A).Sidoqoftë, të dhënat tona sugjerojnë që IFNα rregullon në mënyrë të ndryshme lidhjen e HLA-A me H2B dhe MDN1.IFNα nxit lidhjen midis H2B dhe HLA-A, por redukton lidhjen e tij me MDN1.Ne zbuluam se MDN1 ishte i lidhur me HLA-A në kontrolle dhe shtimi i IFNα e zvogëloi këtë ndërveprim të pavarur nga induksioni i MDN1 nga IFNα (Figura 7B,C).Përveç kësaj, imunoprecipitimi HLA-A kapi H2B në qelizat A549 (Fig. S4), duke sugjeruar që ky ndërveprim është i pavarur nga lloji i qelizave.Të marra së bashku, këto rezultate mbështesin ndërveprimet e ndërmjetësuara nga interferoni të HLA-A me H2B dhe MDN1.
HLA-A bashkë-pastron H2B dhe MDN1.Imunobllotet përfaqësuese endogjene H2B (A) dhe MDN1 (B) u imunoprecipituan nga qelizat Flo-1 të trajtuara me IFNα dhe u hetuan për antitrupat e treguar.IgG e miut dhe lepurit u përdor si kontroll negativ.(C) Sasitë (hyrje) relative të antigjeneve të ndryshëm përshkruhen nga imunoblote të hetuara kundër antitrupave të treguar, β-aktina u përdor si një kontroll ngarkues.
Vetitë strukturore të një prej rrjeteve të ndërlidhura shumë të besueshme të shkaktuara nga interferoni, H2B-HLA-A-HMGA1, u hetuan.Ne përdorëm modelimin e dinamikës molekulare si një qasje alternative për të kuptuar dinamikën konformuese të proteinave të përfshira në këtë kompleks (Figura 8).Konkluzionet nga të dhënat e CLMS sugjerojnë mundësinë e konformacioneve të ndryshme të proteinave H2B, HLA-A dhe HMGA1.Prandaj, komplekset e mëposhtme potenciale u modeluan në një mjedis tretës: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A dhe H2B-HLA-A-HMGA1.Një ekran fillestar lidhës proteine-proteine ​​duke përdorur paketën MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) sugjeroi konformacione të mundshme që ndryshojnë midis këtyre proteinave (Fig. 8A).Vizualizimi i kompleksit të proteinave lidhëse zbuloi disa ndërveprime dhe konformacione të mundshme (Figura 5A, 8).Kështu, një konformacion i mundshëm është paraqitur në Figurën 8A (me lidhje të kryqëzuara të etiketuara) dhe është vlerësuar më tej duke përdorur tubacionin e modelimit MD.Përveç kësaj, lidhja e H2B ose HMGA1 me HLA-A nxjerr në pah afinitetin më të lartë të H2B për HLA-A (Fig. 8A).
Dinamika konformative e rrjeteve të mundshme ndërmjet komplekseve H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A dhe H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Paneli i majtë është një hartë 2D (e krijuar në softuerin SIM-XL) e lidhjeve ndërmolekulare (të kuqe) dhe ndërmolekulare (blu) (ndërprerja e lidhjeve të vendosura në 3.5).Përveç kësaj, mbetjet e ndërlidhjes të identifikuara janë etiketuar në strukturat e proteinave H2B, HLA-A dhe HMGA1.Konformacionet shoqëruese të këtyre proteinave u nxorrën duke përdorur tubacionin docking të zbatuar në paketën MOE.Paneli i poshtëm majtas tregon konformacionet e ndryshme të mundshme të komplekseve H2B-HLA-A dhe HMGA1-HLA-A me afinitete të ndryshme lidhëse proteinash-proteine ​​(GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Devijimi standard (RMSD) i pozicioneve atomike (duke përjashtuar atomet e hidrogjenit) për çdo strukturë proteine.(C) Ndërveprimet ndërmolekulare të lidhjes hidrogjenore protein-proteinë nga komplekse të ndryshme të simuluara duke marrë parasysh ndërveprimet specifike me kohëzgjatje ≥ 10 ns.Distanca e ndërprerjes së dhuruesit-pranuesit të lidhjes h u caktua në 3,5 Å, dhe këndi i ndërprerjes së dhuruesit-marrësit H u vendos në ≥ 160°-180°.(D) Mbetjet e etiketuara që formojnë ndërveprime proteine-proteinë HLA-A me partnerët e tyre përkatës, që përfshijnë ≥ 20 ns, të nxjerra nga komplekset e rreme HLA-A-H2B dhe HLA-A-HMGA1.Strukturat e proteinave përfaqësojnë një strukturë mesatare prej 100 ns MDS.(E) Ndërveprimet midis komplekseve HLA-A-H2B dhe HLA-A-HMGA1 krahasuar me ndërveprimet e gjurmuara nga simulimi H2B-HLA mbi 100 ns bazuar në vendin e ndërveprimit K ose S midis dy peptideve.Komplekset /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Vlera e pragut për vlerësimin e lidhjeve të kryqëzuara u caktua në 3.0 dhe u morën parasysh ndërveprimet specifike nga MDS duke marrë ≥ 10 ns.Strukturat e proteinave u vizualizuan duke përdorur paketat BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) dhe Mjedisin Molecular Operating (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabiliteti i molekulave HLA-A me kalimin e kohës (devijimi standard; RMSD ose devijimi standard; RMSF) tregoi se prania e proteinave H2B ose HMGA1 në komplekse stabilizoi HLA-A (Figura 8B, Figura S5).Proteina HMGA1 lidhet fort me vendin B2M të HLA-A, duke nxitur qëndrueshmërinë e aminoacideve HLA-A në kompleksin HLA-A-HMGA1 ose H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).në veçanti, mbetjet HLA ~60-90 dhe ~180-210 u gjetën të jenë më pak fleksibël në prani të H2B (Fig. 8B).H2B dhe HMGA1 treguan lidhje më të mirë me HLA-A në kompleksin H2B-HLA-A-HMGA1 krahasuar me lidhjen HLA-A me H2B ose HMGA1 vetëm (Figura 8C,D; Tabela S5).Mbetjet e përfshira në lidhjen hidrogjenore (përdorimi i lartë i modeluar nga MD ≥ 10 ns) përkojnë me vendet e ndërveprimit CLMS (mbetjet K ose S) në kompleks, duke sugjeruar që ndërveprimet e identifikuara nga CLMS janë shumë të besueshme.Besueshmëria (Fig. 8E ).Në modelimin CLMS dhe MD, mbetjet HLA-A midis rreth 190-210 dhe rreth 200-220 aminoacide u gjetën se lidhnin H2B dhe HMGA1, përkatësisht (Fig. 8E).
Ndërveprimet protein-proteinë formojnë rrjete strukturore dinamike që ndërmjetësojnë komunikimin ndërqelizor në përgjigje të stimujve të caktuar.Për shkak se shumë qasje të proteomikës zbulojnë ndryshime në nivelin e përgjithshëm të gjendjes së qëndrueshme të një proteine, dinamika e ndërveprimit protein-proteinë kërkon mjete shtesë për të kapur ndërfaqet lidhëse, dhe CLMS është një mjet i tillë.Sistemi i sinjalizimit të interferonit është një rrjet citokine që lejon qelizat t'i përgjigjen një sërë sinjalesh patologjike patogjene dhe të brendshme mjedisore, duke kulmuar në induksionin e nëngrupeve të proteinave të induktueshme nga interferoni.Ne aplikuam CLMS për të përcaktuar nëse ndërveprimet e reja protein-proteinë mund të identifikoheshin midis një paneli proteinash të induktuara nga interferoni.Analiza globale e ndërlidhjes së proteinave në një model qelizor Flo-1 të përgjegjshëm ndaj interferonit u përdor për të kapur komplekset e proteinave.Nxjerrja e peptideve triptike nga qelizat jo të ndërlidhura dhe të ndërlidhura lejon numërimin e peptideve, pasurimin e rrugës dhe shpërndarjen e gjatësisë së peptideve me intensitet të përcaktuar LFQ.Proteinat kanonike të induktueshme nga interferoni u identifikuan si një kontroll i brendshëm pozitiv, ndërsa u vëzhguan addukte të reja ndërmolekulare dhe intramolekulare të ndërlidhura të proteinave kanonike të induktueshme nga interferoni si MX1, UP18, OAS3 dhe STAT1.Janë hetuar tipare të ndryshme strukturore dhe ndërveprime në zonat funksionale.
Një ndërveprim midis HLA-A, MDN1 dhe H2B u zbulua nga imunoblotting në qelizat Flo-1 dhe A549 të trajtuara dhe të patrajtuara me IFNα.Rezultatet tona theksojnë se HLA-A kompleksohet me H2B në një mënyrë të varur nga IFNα.Puna jonë paraqet një rrugë interesante për eksplorimin e mëtejshëm të bashkëlokalizimit të këtyre dy komplekseve.Do të ishte gjithashtu interesante të zgjerohej qasja CLMS në një panel linjash qelizore për të identifikuar ndërveprimet e proteinave të ndërmjetësuara nga interferoni të pavarur nga lloji qelizor.Së fundi, ne përdorëm modelimin MD si një qasje alternative për të kuptuar dinamikën konformuese të proteinave të përfshira në kompleksin H2BFS-HLA-A-HMGA1, i cili gjurmoi bisedimet ndërmolekulare dhe ndërmolekulare.Konkluzionet nga të dhënat CLMS sugjerojnë mundësinë e konformacioneve të ndryshme të proteinave H2BFS, HLA-A dhe HMGA1.Konformacionet e mundshme të ndryshme midis këtyre komplekseve të proteinave lidhëse zbuluan disa ndërveprime të ngjashme me ato të vëzhguara në grupin e të dhënave CLMS.Një nga pikat e forta të metodës sonë është se ajo lejon identifikimin e lehtë të gjeneve shumë polimorfike që ndërveprojnë si HLA, kështu që do të jetë interesante të studiohen ndërveprimet e proteinave specifike të hapotipit HLA që përndryshe janë të vështira për t'u studiuar.Të marra së bashku, të dhënat tona tregojnë se CLMS mund të përdoret për të zgjeruar kuptimin tonë për rrjetet sinjalizuese të induktuara nga interferoni dhe për të ofruar një bazë për studimin e sistemeve ndërqelizore më komplekse në mikromjedisin e tumorit.
Qelizat Flo-1 u morën nga ATCC dhe u mbajtën në DMEM (Gibco) të plotësuar me 1% penicilinë/streptomicinë (Invitrogen), 10% serum fetusi të gjedhit (Gibco) dhe u ruajtën në 37°C dhe 5% CO2.Inkubacioni.Qelizat u rritën në 70-80% bashkim përpara se të trajtoheshin me IFNα14 (prodhuar nga Edinburgh Protein Production Facility).Të gjitha kimikatet dhe reagentët e tjerë janë blerë nga Sigma Aldrich, përveç rasteve kur shënohet ndryshe.
Qelizat Flo-1 u kultivuan në pllaka me 6 pusi dhe të nesërmen qelizat u trajtuan me 10 ng/ml IFNα14 për 24 orë deri në konfluencë afërsisht 80%.Qelizat u lanë tre herë me PBS dhe u lidhën me DSS të sapopërgatitur (Thermo Fisher Scientific) (të tretur në DMSO) në PBS për 5 minuta në 37° C. deri në një përqendrim përfundimtar prej 0.5 mM.Reaksioni i ndërlidhjes DSS u zëvendësua me PBS dhe DSS e mbetur u shua duke shtuar 20 mM Tris (pH 8.0) në PBS për 15 minuta në 37°C.Qelizat u mblodhën me gërvishtje dhe u mblodhën në tuba me lidhje të ulët (Axygen).
Peleti qelizor u lizua me 300 µl bufer lize ure (8 M ure, 0,1 M Tris, pH 8,5) për 30 minuta në temperaturën e dhomës me tundje të herëpashershme.Të gjitha hapat e centrifugimit u kryen në 14,000 xg në 8°C.Centrifugoni lizatin për 10 minuta dhe transferojeni supernatantin në një tub të ri.Grimcat e mbetura të qarta u tretën në 150 μl të tamponit të dytë të lizës (2 M ure, 2% (w/v) SDS (sodium dodecil sulfate)) për 30 minuta ose më shumë derisa të përftohej një zgjidhje ujore homogjene.Lizati u centrifugua për 20 minuta dhe supernatanti u përzier me lizatin e marrë në hapin e mëparshëm.Përqendrimet e proteinave u vlerësuan duke përdorur analizën Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) sipas udhëzimeve të prodhuesit për procedurat e mikropllakës.Mostrat u ngrinë shpejt në azot të lëngshëm dhe u ruajtën në -80°C.
Përafërsisht 100 μg proteinë të ndërlidhur të tretshme u përpunua duke përdorur një protokoll të modifikuar të përgatitjes së mostrës së filtrimit (FASP) siç përshkruhet nga Wisniewski et al.69 Shkurtimisht, proteina lidhet me 200 µl bufer ure (8 M ure në 0,1 M Tris, pH 8,5), vorbullohet dhe përgjysmohet.Të gjitha hapat e centrifugimit u kryen në 14,000 xg në 25°C.Gjysma e parë e lizës së proteinave të ndërlidhura u transferua në një pajisje filtri centrifugale Microcon 10 kDa e pajisur me një membranë Ultracel-10 (Merck), e ndjekur nga centrifugimi në filtër për 25 minuta.Pastaj shtoni gjysmën e dytë të proteinës në filtër dhe përsëritni të njëjtat hapa.Rikuperimi i proteinave u krye duke shtuar 100 μl hidroklorur tris(2-karboksietil)fosfine (TCEP) 17 mM në tampon ure.Rikuperimi u trazua në një termomikser në 600 rpm për 30 minuta në 37°C.Përveç kësaj, kolona u centrifugua dhe proteina e reduktuar e ndërlidhur u alkilua duke përdorur 100 μl jodoacetamide 50 mM në tampon ure.Reaksioni i alkilimit u krye në temperaturën e dhomës për 20 minuta në errësirë.Rrotulloni kolonën, lani muret e kolonës 3 herë me 100 µl bufer ure dhe më pas centrifugoni.I njëjti operacion u krye 3 herë duke përdorur 100 μl bikarbonat amoni 100 mM.Para tripsinizimit, zëvendësoni tubin e grumbullimit me një të ri.Shtoni tampon tretës që përmban 50 mM bikarbonat amoni dhe 1 µl tripsinë të holluar në tampon tripsinë (Promega).Raporti i tripsinës me proteinën u mbajt në rreth 1:33 dhe reaksionet e tretjes u inkubuan gjatë natës në 37 ° C. në një dhomë të lagësht.Peptidi i ndërlidhur u elua nga filtri me centrifugim për 25 minuta.Rikuperimi i peptideve u përmirësua duke shtuar 50 μl 0,5 M NaCl në filtër, e ndjekur nga centrifugimi për 25 minuta.
Kolonat C18 Micro Spin (Aparati i Harvardit) u përdorën për të dekripuar peptidet triptike të ndërlidhura sipas protokollit të përshkruar nga Bouchal et al.70 me modifikime të vogla.Shkurtimisht, kolonat e rrotullimit C18 u aktivizuan me tre larje me acid formik 0,1% (FA) në acetonitril (AcN) (Merck) dhe dy larje me 0,1% FA.Kolona u hidratua me 0.1% FA për 15 minuta.Ngarkoni mostrat në kolonat e rrotullimit dhe lani 3 herë me 0,1% FA.Peptidet e shkripëzuara u eluan në mënyrë sekuenciale me një gradient hap pas hapi duke përdorur 50%, 80% dhe 100% AcN në 0.1% FA.Mostrat u thanë në një koncentrator SpeedVac Plus (Eppendorf) derisa lëngu i mbetur u zhduk plotësisht.Peptidet e elutura u tretën në 100 μl acid trifluoroacetik 0.08% në 2.5% AcN dhe përqendrimet u matën në një NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Përafërsisht 1 μg peptid të ndërlidhur për mostër u injektua në sistemin LC-MS/MS.
Peptidet e ndërlidhura u ndanë në një sistem UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) i lidhur me një spektrometër masiv Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptidet e ndërlidhura u mblodhën në një kolonë kapëse me ID 300 μm, 5 mm të gjatë μ-para kolonës C18 e mbushur me sorbent C18 PepMap100 dhe sorbent PepMap 5 μm (Thermo Scientific).Ngarkoni rrjedhën e pompës të vendosur në 5 µl/min 0,08% acid trifluoroacetik i tretur në 2,5% AcN.Peptidet e ndërlidhura u ndanë në një kolonë silicë të shkrirë analitike me një diametër të brendshëm 75 μm dhe një gjatësi prej 150 mm, të mbushur me një sorbent PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Fazat e lëvizshme A dhe B përbëheshin nga 0,1% FA në ujë dhe 0,1% FA në acetonitril, respektivisht.Gradienti fillon në 2,5% B dhe rritet në mënyrë lineare në 40% B gjatë 90 minutave, pastaj në 90% B gjatë 2 minutave të ardhshme.Përbërja e fazës së lëvizshme u mbajt në 90% B për 10 minuta dhe më pas u ul në mënyrë lineare në 2.5% B për 2 minuta.Kolona u ekuilibrua në 2.5% B për 8 minuta përpara ciklit të ardhshëm.Peptidet e ndërlidhura të elutura nga kolona analitike u jonizuan në një burim jonizimi me nanoelektrospraj (NSI) dhe u injektuan në një spektrometër masiv Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spektometri i masës Orbitrap Exploris 480 funksiononte në modalitetin e korrelacionit pozitiv të të dhënave.Një skanim i plotë u krye në modalitetin e seksionit me një rezolucion prej 120,000 me parametrat e diapazonit nga m/z 350 Th deri në m/z 2000 Th.Objektivi i normalizuar i AGC u vendos në 300% me një kohë maksimale të hyrjes prej 50 ms.Zbulimi i pikut monoizotopik është krijuar për peptidet.Parametri i relaksimit të kufizimeve vendoset si i vërtetë nëse gjenden shumë pak prekursorë.Forca minimale jonike e pararendësit u vendos në 5.0e3 dhe gjendjet e ngarkesës së prekursorëve deri në +8 u përfshinë në eksperimente.
Koha e ciklit ndërmjet skanimeve kryesore në modalitetin e korrelacionit të të dhënave u caktua në 2,5 sekonda.Përjashtimi i masës dinamike u vendos në 20 s pas fragmentimit të parë të jonit pararendës.Dritarja e izolimit të pararendësit u vendos në 2 Th.Lloji i energjisë së normalizuar të përplasjes me një modalitet të energjisë së përplasjes fikse u zgjodh në një skanim MS/MS të varur nga të dhënat.Energjia e përplasjes është vendosur në 30%.Rezolucioni i Orbitrap u vendos në 15,000 dhe objektivi AGC në 100%.Koha maksimale e personalizuar e injektimit është vendosur në 60 milisekonda.
Përpara se të gjurmojmë rrjetin protein-proteinë në mostrat e ndërlidhura, ne përpunuam skedarët e papërpunuar duke përdorur paketën MaxQuant (versioni 1.6.12.0)26,27 për të identifikuar peptidet/proteinat e gjurmueshme në mostra.Për më tepër, analiza të ngjashme proteomike u kryen në mostrat Flo-1 të pandërlidhura të trajtuara dhe të patrajtuara me IFNα.Të dhënat MS/MS u kërkuan në bazën e të dhënave njerëzore UniProt (www.uniprot.org) (i ngarkuar më 12 gusht 2020, përmban 75,093 hyrje) duke përdorur motorin e integruar të kërkimit Andromeda27.Kërkimi u krye pa treguar specifikën e enzimës dhe modifikimet e ndryshme të deamidimit (N, Q) dhe oksidimit (M).Tolerancat e masës së prekursorëve u vendosën në 20 ppm dhe jonet e produktit në 0.02 Da.Devijimi fillestar dhe maksimal i masës u vendos në 10 ppm.Masa maksimale e peptidit u vendos në 4600 Da dhe ngjashmëria e sekuencës u vendos midis 7 dhe 25 aminoacide (aa).Analiza e mëtejshme statistikore u krye duke përdorur programin Perseus (versioni 1.6.10.45).Përmbajtja e proteinës u llogarit duke normalizuar intensitetin spektral të proteinës (intensiteti LFQ; sasia e paetiketuar)27 dhe vlerat e intensitetit u konvertuan në Log2.Një grupim hierarkik i proteinave të identifikuar nga intensiteti i tyre peptid u ndërtua duke përdorur paketën pheatmap (v1.0.12) në R (v 4.1.2).Analiza e pasurimit të rrugës u krye duke përdorur bazën e të dhënave të rrugës Reactome për proteinat e trajtuara me IFNα që ishin më shumë se katër herë të aktivizuara në krahasim me mostrat e patrajtuara.
Identifikimi i lidhjeve kimike specifike të lizinës (K) ose serinës (S) të komplekseve proteinike të monitoruara nga LC-MS/MS u krye duke përdorur një makinë identifikimi spektroskopik (SIM-XL) për peptidet e ndërlidhura (SIM-XL)29.Së pari, ndërveprimet e mundshme ndërmjet gjeneve të nënshkrimit të rezistencës ndaj dëmtimit të ADN-së (IRDS) të lidhur me interferonin (IFN) u hetuan duke përdorur grupin e të dhënave të proteinave IRDS të përshkruar në Padariya et al.28.Ekzaminimi i të gjitha kushteve dhe përsëritjeve të të gjithë UniProt-it njerëzor është kompjuterikisht intensiv, kështu që e gjithë baza e të dhënave njerëzore UniProt (www.uniprot.org) (shkarkuar më 12 gusht 2020, përmban 75,093 hyrje) kundër përsëritjeve të trajtuara me IFNα.Një nga filtrat për ndërveprime me besim të lartë.Këto ndërveprime me rëndësi të lartë të marra u zgjeruan dhe u testuan në të gjitha përsëritjet dhe kushtet.
Në SIM-XL, DSS u përdor për ndërlidhësin (XL) dhe zhvendosja e peshës XL dhe ndryshimi i peshës së modifikimit u caktuan përkatësisht në 138.06 dhe 156.07.Janë konsideruar vendet e mëposhtme të reagimit të ndërlidhjes: KK, KS dhe KN-TERM, pa jone raportues.Si pararendësi ashtu edhe ppm i fragmentit u vendosën në 20 dhe pragu i Xrea u vendos në 0.15.Tripsina u konsiderua të ishte plotësisht specifike dhe u zbatua një metodë e fragmentimit të C-kurthit me energji të lartë (HCD).Pragu i reduktimit dinamik të DB-së XCorr dhe numri minimal i peptideve për reduktimin dinamik të DB-së u vendosën në 2.5 dhe 2, respektivisht.Parametra të tjerë janë: probabiliteti i monoizotopit dhe ndërprerja e koincidencës së pikut, minimumi 4 mbetje AA për fije dhe ngarkesa maksimale e fillesë, dhe 3 maksimum të ndarjeve të humbura.Hartat 2D të qepura që rezultuan u analizuan në (SIM-XL) dhe paraqitja grafike xQuest28 u përdor për të ndërtuar hartat 2D.Lidhjet e kryqëzuara të proteinave në strukturat e proteinave ofrohen në PyMol (Sistemi Molecular Graphics PyMOL, versioni 2.0 Schrödinger, LLC).
Strukturat e modelit të proteinave u krijuan duke përdorur serverin Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 duke përdorur parimet e modelimit të homologjisë dhe zbatimit të "Metodës së Fshehur Markov".Phyre2 gjeneron struktura modele bazuar në rreshtimin e sekuencës me strukturat e njohura të proteinave.Për proteinat H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 dhe MDN1, u përdorën strukturat shabllone 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 dhe 6i2665.Për më tepër, struktura e AlphaFold71 MX1, UBP18 dhe ROBO1 u konsiderua gjithashtu.Struktura e proteinave u vizualizua duke përdorur paketën BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) dhe paketën Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).