ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tub i salduar dyfish për komponentin kimik të industrisë kimike, mungesa e SPECC1L çon në rritjen e stabilitetit të nyjeve të bashkuara dhe zvogëlimin e derdhjes së qelizave të kreshtës nervore kraniale.

Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tub i salduar dyfish për industrinë kimike

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.është një prodhuesi kryesor i cili është i specializuar në tuba prej çeliku inox, tuba të ndezur të ndezur, tuba të mbështjellë pa probleme etj.Për të lehtësuar klientët, ne kemi salduar tuba dhe tuba gjithashtu.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ka pajisjet më të avancuara të prodhimit dhe testimit.Ne mund të plotësojmë plotësisht kërkesën tuaj .Sipas standardit shumë strikte, tubat që prodhohen nga ne kanë gjithmonë tolerancë korrekte OD dhe WT.Kontrolli i tolerancës është rreptësisht në përputhje me standardet e prodhimit.Produktet tona janë gjithmonë të kënaqur me klientët.Klientët blenë produktet tona krijuan më shumë fitime.
a) OD (diametri i jashtëm): 3.18 mm deri në 101.6 mm
b) WT (Trashësia e murit): 0,5 mm deri në 20 mm
c) Gjatësia: Sipas kërkesës së klientit
d) Standardet: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etj
e) Metoda e procesit: ERW, EFW etj

Rrëshqitës që tregojnë tre artikuj për rrëshqitje.Përdorni butonat e pasëm dhe të ardhshëm për të lëvizur nëpër rrëshqitje, ose butonat e kontrolluesit të rrëshqitjes në fund për të lëvizur nëpër secilën rrëshqitje.
Qelizat e kreshtës nervore kraniale (CNCC) largohen nga palosjet nervore embrionale dhe migrojnë në harqet e faringut, të cilat formojnë shumicën e strukturave të mesit të fytyrës.Mosfunksionimi i CNCC luan një rol të rëndësishëm në etiologjinë e çarjes orofaciale, një keqformim i zakonshëm kongjenital.Mutacionet heterozigote SPECC1L janë gjetur te pacientët me çarje atipike dhe sindromike.Këtu, ne raportojmë ngjyrosje të zgjeruar të përbërësve të kryqëzimit kanonik ngjitës (AJ), β-catenin dhe E-cadherin në qelizat e kultivuara të SPECC1L-së, dhe mikrografët elektronikë tregojnë difuzionin apikal-bazal të AJ.Për të kuptuar rolin e SPECC1L në morfogjenezën kraniofaciale, ne krijuam një model miu me mangësi Specc1l.Mutantët homozigotë janë vdekjeprurës embrional dhe shfaqin mbyllje të dëmtuar të tubit nervor dhe petëzimin CNCC.Ngjyrosja e proteinës AJ është rritur në palosjet nervore mutante.Ky defekt AJ është në përputhje me një defekt në delamination CNCC, që kërkon shpërbërjen AJ.Për më tepër, mutantët Spec11 kanë reduktuar sinjalizimin PI3K-AKT dhe kanë rritur apoptozën.In vitro, frenimi i lehtë i sinjalizimit PI3K-AKT në qelizat e tipit të egër ishte i mjaftueshëm për të nxitur ndryshimet e AJ.E rëndësishmja, ndryshimet AJ të shkaktuara nga rrëzimi i SPECC1L mund të ndryshohen nga aktivizimi i rrugës PI3K-AKT.Të marra së bashku, këto të dhëna sugjerojnë se SPECC1L, si një rregullator i ri i sinjalizimit PI3K-AKT dhe biologjisë AJ, kërkohet për mbylljen e tubit nervor dhe shtresimin CNCC.
Qelizat e kreshtës nervore kraniale (CNCC) lokalizohen në neuroektodermën dorsale dhe shkëputen nga neuroepiteli i palosjeve nervore në zhvillim përmes një procesi që përfshin tranzicionin epitelial-mezenkimal (EMT)1,2,3.CNCC-të epiteliale premigruese prishin nyjet ndërqelizore dhe shndërrohen në CNCC mezenkimale migruese që mbushin harkun e parë dhe të dytë të faringut dhe formojnë pjesën më të madhe të kërcit kraniofacial.Kështu, gjenet që rregullojnë funksionin e CNCC shpesh ndërpriten në etiologjinë e anomalive kongjenitale kraniofaciale si çarjet orofaciale, që më së shpeshti prekin 1/800 lindje vetëm në SHBA.Një nga deformimet e lindura8.
Delaminimi i CNCC përkon me mbylljen e tubit nervor anterior midis 8.5 dhe 9.5 ditëve të zhvillimit embrional te minjtë.Mutantët e një numri gjenesh të lidhura me çarjen orofaciale të miut shfaqin gjithashtu një formë të defektit të tubit nervor, duke përfshirë Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 dhe Pdgfrα12.Sidoqoftë, proceset e mbylljes së tubit nervor dhe shtresimit CNCC mund të konsiderohen të pavarura, pasi miu mutant Splotch (Pax3) shfaq defekte në mbylljen e tubit nervor pa asnjë efekt në shtresimin ose migrimin CNCC 13,14.Modele shtesë të miut me defekte në diseksionin CNCC dhe mbylljen e tubit nervor do të ndihmojnë në përcaktimin e bazës së përbashkët molekulare të këtyre dy proceseve.
Izolimi i CNCC nga qelizat neuroepiteliale kërkon shpërbërjen e lidhjeve ngjitëse (AJs), të cilat përbëhen nga komplekse proteinike që përmbajnë, ndër të tjera, E-kadherinë, β-catenin, α-E-catenin dhe α-aktininë të lidhur me filamente të aktinës 2 Studimet e mbishprehjes E-cadherin në palosjet nervore treguan një reduktim ose vonesë në delaminimin e CNCC.Anasjelltas, shtypja e E-kadherinës rezulton në shtresim të hershëm15,16.Shumë nga faktorët që ndërmjetësojnë EMT gjatë shtresimit CNCC janë faktorët e transkriptimit (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) dhe proteinat rimodeluese të matricës jashtëqelizore (ECM) si metaloproteinazat e matricës (MMPs), megjithatë CNCC janë citoskeletë direkte AJJ ende nuk dihet.Rruga PI3K-AKT është e njohur për antagonizimin e niveleve të E-cadherinës, kryesisht nga kërkimet e kancerit17.Studimet e fundit kanë treguar se humbja e sinjalizimit PI3K-AKT me bazë PDGFα te minjtë çon në anomali kraniofaciale, duke përfshirë defektet e qiellzës së çarë dhe të tubit nervor12.Megjithatë, marrëdhënia midis rrugës PI3K-AKT dhe stabilitetit të AJ në shtresimin e CNCC është e paqartë.
Ne kemi identifikuar më parë SPECC1L si gjenin e parë mutant në dy njerëz me një çarje të rëndë që shtrihet nga goja në sy, e njohur si çarje e zhdrejtë (ObFC) ose çarje Tessier IV18.Mutacionet SPECC1L janë identifikuar në dy familje shumë brezash me sindromën autosomale dominante Opitz G/BBB (OMIM #145410), në të cilën individët e prekur shfaqën hiperdistancë dhe çarje të buzës/qiellzës19, dhe në një familje me sindromën e mbidistancës Tibi (OM4202014) .më shumë se gjysma e rasteve të sindromës Opitz G/BBB janë të lidhura me X (OMIM #300000) dhe shkaktohen nga mutacionet në gjenin MID1, i cili kodon proteinën 22 të skeletit qelizor të lidhur me mikrotubulat.Ne supozojmë se SPECC1L, gjithashtu një proteinë e lidhur me mikrotubulat dhe citoskeletin e aktinës, mund të ndërmjetësojë sinjalizimin e kërkuar për rimodelimin e citoskeletit të aktinës gjatë ngjitjes dhe migrimit të qelizave 18 .Nëpërmjet studimeve in vitro dhe in vivo, ne tani e përshkruajmë SPECC1L si një rregullator të ri të stabilitetit të AJ përmes sinjalizimit PI3K-AKT.Në nivel qelizor, mungesa e SPECC1L rezultoi në një ulje të nivelit të proteinës pan-AKT dhe një rritje të shpërndarjes apikale-bazale të AJ, e cila u eliminua nga aktivizimi kimik i rrugës AKT.In vivo, embrionet me mungesë Spec11 tregojnë mbyllje të dëmtuar të tubit nervor dhe diseksion të reduktuar të CNCC.Kështu, SPECC1L funksionon në sinjalizimin shumë të rregulluar të bazuar në ngjitjen e qelizave të nevojshme për funksionin normal të CNCC gjatë morfogjenezës së fytyrës.
Për të karakterizuar rolin e SPECC1L në nivel qelizor, ne përdorëm linjën qelizore të qëndrueshme të osteosarkomës së përshkruar më parë, U2OS, e mangët në SPECC1L18.Këto qeliza të qëndrueshme U2OS me rënie të SPECC1L (kd) patën një rënie të moderuar (60-70%) në nivelet e transkripteve dhe proteinave SPECC1L, së bashku me defekte në migrim dhe riorganizim të citoskeletit të aktinës 18. Në të kundërt, një rënie e rëndë kalimtare në SPECC1L është treguar se çon në defekte mitotike 23 .Pas karakterizimit të mëtejshëm, ne zbuluam se qelizat tona të qëndrueshme SPECC1L-kd ndryshuan morfologjinë në një shkallë shumë të lartë bashkimi (Figura 1).Qelizat individuale të kontrollit dhe qelizat kd në bashkim të ulët dukeshin të ngjashme (Figura 1A,D).24 orë pas bashkimit, qelizat e kontrollit ruajtën formën e tyre kuboide (Fig. 1B, E), ndërsa qelizat SPECC1L-kd u zgjatën (Fig. 1C, F).Shtrirja e këtij ndryshimi në formën e qelizës u kap nga imazhi i drejtpërdrejtë in vivo i qelizave kontrolluese dhe qelizave kd (filmi 1).Për të përcaktuar rolin e SPECC1L në qelizat konfluente, së pari kemi ekzaminuar shprehjen e tij.Ne zbuluam se nivelet e proteinës SPECC1L u rritën pas bashkimit (Figura 1G), ndërsa nivelet e transkriptit SPECC1L nuk u rritën (Figura 1H).Përveç kësaj, me rritjen e densitetit të qelizave, proteina SPECC1L u grumbullua në kufijtë ndërqelizor (Fig. 2A-E), me një model që mbivendoset me atë të β-catenins së lidhur me membranën (Fig. 2A'-E').Duke pasur parasysh lidhjen e SPECC1L me citoskeletin e aktinës 18,23, ne supozuam se SPECC1L ndërvepron me nyjet ngjitëse të bazuara në aktinë (AJ).
(AF) Qelizat SPECC1L nockdown (DF) zgjaten në bashkim të lartë (F) krahasuar me qelizat e kontrollit U2OS (AC).Këtu tregohen tre nga gjashtë pikat kohore (T1, T3, T6) që kemi zgjedhur për dendësi të ndryshme qelizash.(G) Analiza Western blot që tregon se proteina SPECC1L është e stabilizuar në një shkallë të lartë bashkimi në krahasim me një shkallë të ulët të bashkimit në qelizat e kontrollit.Njohja perëndimore e SPECC1L tregon brezin e pritur 120 kDa dhe një brez me peshë molekulare më të lartë, ndoshta të modifikuar pas përkthimit (*).Analiza Western blot u krye në të njëjtat kushte për bashkim të ulët dhe të lartë.Imazhet që tregojnë SPECC1L në bashkim të ulët dhe të lartë janë marrë nga i njëjti blot.E njëjta njollë u hoq dhe u riekzaminua me antitrupa β-aktine.(H) Analiza sasiore RT-PCR nuk tregoi ndryshime të rëndësishme në nivelet e transkriptit SPECC1L.Shiritat e gabimit përfaqësojnë SEM nga katër eksperimente të pavarura.
(AE) Ne zgjodhëm gjashtë pika kohore (T1-T6) që përfaqësojnë një sërë densitetesh qelizash për të normalizuar analizën e formës së qelizës dhe ndryshimet AJ në qelizat U2OS me SPECC1L nockdown (kd).Pesë të parat e këtyre pikave kohore përfshinin qeliza të vetme (T1), bashkim 50-70% të grupimeve të vogla të qelizave (T2), shkrirje pa riformësuar qelizat kd (T3), riformësim të qelizave kd (T4) dhe ndryshime 24 orëshe.në formën e pasme të qelizave kd (T5).Proteina SPECC1L u shpërnda kryesisht në citoplazmë në T1 (A), por akumulimi i saj u vu re në kufijtë ndërqelizor në pikat pasuese kohore (B-E, shigjeta).(FJ) β-catenin tregon akumulim të ngjashëm në kufijtë ndërqelizor të lidhur me kompleksin AJ.(A'-E') SPECC1L dhe β-catenin tregojnë ngjyrosje të mbivendosur në kufijtë e qelizave me densitet të lartë qelizor (shigjeta).(F'-J') Në ​​qelizat SPECC1L-kd, ngjyrosja e β-kateninës duket normale me densitet të ulët qelizor (F'-H'), por zgjerohet me ndryshimin e formës së qelizës (I', J'; shigjeta), duke treguar se AJ kanë ndryshuar.Shufra = 10 µm.
Më pas ne u përpoqëm të përcaktonim efektin e mungesës së SPECC1L në AJ.Ne përdorëm disa shënues të lidhur me AJ, duke përfshirë përbërësit kanonikë F-actin, miozin IIb, β-catenin dhe E-cadherin24,25,26,27.Fijet e stresit të aktinës u rritën në qelizat SPECC1L-kd siç përshkruhet më parë (Fig. 3A, B) 18 .Miozina IIb e lidhur me filamentet e aktinës tregoi një rritje të ngjashme në qelizat SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).β-catenin-i i lidhur me AJ lidhet me kadherinën në membranën qelizore, duke treguar një model shprehjeje normale të "huall mjalti" në kubocitet e kontrollit (Fig. 3E,G).Interesante, në imazhet e sheshta duke përdorur mikroskopinë konfokale, njollosja e β-catenin (Fig. 3E,F) dhe E-cadherin (Fig. 3G,H) në membranën qelizore të qelizave konfluente me mungesë SPECC1L treguan modele të spikatura të ngjyrosjes së zgjatur.Ky zgjerim i ngjyrosjes β-catenin të lidhur me AJ në qelizat kd ishte më i theksuar në konfluencë, por dukej se i paraprinte ndryshimeve në formën e qelizës (Fig. 2F-J, F'-J').Për të përcaktuar natyrën fizike të këtij ngjyrimi të zgjatur AJ, ne ekzaminuam kufijtë e qelizave në sipërfaqen apikale-bazale të qelizave SPECC1L-kd U2OS me mikroskop elektronik transmetues (TEM) (Figura 3I, J).Ndryshe nga qelizat e kontrollit (Fig. 3I), të cilat kishin rajone të ndara të dendura me elektron që tregojnë AJ (shigjeta), qelizat kd (Fig. 3J) treguan rajone të mëdha, të ngjitura me densitet të lartë elektronik që tregon AJ përgjatë planit apikobazal..Përveç kësaj, në seksione tërthore, ne vëzhguam palosje të gjera të membranës qelizore në qelizat kd (Fig. S1A, B), gjë që shpjegon modelin e zgjeruar të brezave të ngjyrosjes së β-catenin dhe E-kadherinë (Fig. 3F, H).Në mbështetje të rolit të SPECC1L në AJ, β-catenin u bashkë-imunoprecipitua me SPECC1L në lizat e qelizave U2OS të bashkuara (Fig. 3K).Së bashku me imuno-ngjyrosjen e zgjatur për shënuesit AJ, analiza TEM ishte në përputhje me hipotezën tonë se mungesa e SPECC1L rrit densitetin dhe variancën apikale-bazale të AJ.
(AH) Rritja e ngjyrosjes së F-aktinës në qelizat kd në 48 orë pas bashkimit (T6; A, B).Ngjyrosja e ndryshuar e miozinës IIb e lidhur me F-aktinën (C, D).Modeli i qetë i ngjyrosjes së membranës β-catenin dhe E-kadherinë në qelizat e kontrollit (E, G) u përmirësua në qelizat SPECC1L-kd (F, H).Shufra = 10 µm.(I–J) Mikrografë elektronike që vëzhgojnë bashkimin ndërqelizor apikal-bazal.Qelizat e kontrollit tregojnë rajone të dallueshme të dendura me elektron që tregojnë kryqëzime ngjitëse (I, shigjeta).Në të kundërt, i gjithë kryqëzimi apikal-bazal në qelizat SPECC1L-kd u shfaq i dendur elektronik (J, shigjeta), që tregon densitet dhe shpërndarje të shtuar të kryqëzimeve ngjitëse.(K) β-katenina u bashkë-imunoprecipitua me SPECC1L në lizat e qelizave U2OS të bashkuara.Imazhi i marrë nga një pikë që përfaqëson një nga katër eksperimentet e pavarura.
Për të kuptuar rolin e SPECC1L në morfogjenezën kraniofaciale, ne krijuam një model miu me mangësi Spec1l duke përdorur dy linja qelizore të pavarura kurth ES, DTM096 dhe RRH048 (BayGenomics, CA), të cilat përfaqësojnë transkriptet e intronit 1 dhe Specc1l u kapën në 115 (Fig. .4A, figura S2).Vendndodhja gjenomike e insertit të vektorit të mashtrimit u përcaktua nga sekuenca e të gjithë gjenomit dhe u konfirmua me PCR (Fig. S2).Të dy modelet e kurthit të gjeneve lejuan gjithashtu shkrirjen brenda kornizës së reporterëve Specc11-lacZ pas kapjes.Prandaj, shprehja lacZ e përcaktuar nga ngjyrosja X-gal u përdor si një tregues i shprehjes Specc11.Të dy alelet treguan modele të ngjashme të shprehjes lacZ, me kurthin e gjenit DTM096 në intron 1 që tregon shprehje më të fortë se RRH048 në intronin 15 (nuk tregohet).Megjithatë, Spec1l shprehet gjerësisht, me shprehje veçanërisht të fortë në palosjet nervore në E8.5 (Figura 4B), në tubin nervor dhe proceset e fytyrës në E9.5 dhe E10.5 (Figura 4C,D) dhe në gjymtyrët në zhvillim në E10.5 dhe sytë (Figura 4D).Ne raportuam më parë se shprehja e SPECC1L në harkun e parë të faringut në E10.5 ishte e pranishme në epitel dhe mezenkimën themelore18, në përputhje me linjën CNCC.Për të testuar shprehjen SPECC1L në CNCC, ne kryem palosje nervore E8.5 (Figura 4E-J) dhe seksione të kafkës E9.5 (Figura 4K-).Në E8.5, SPECC1L njollos palosjet nervore intensivisht (Fig. 4E, H), duke përfshirë qelizat e ngjyrosura me shënues NCC (Fig. 4G, J).Në E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) CNCC migruese me njolla të forta e bashkënjollosur me AP2A (Fig. 4L, M) ose SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Paraqitja skematike e gjenit Spec11 të miut që tregon futjen e vektorit të mashtrimit në klone qelizore ES DTM096 (intron 1) dhe RRH048 (intron 15).(BD) ngjyrosje lacZ e embrioneve heterozigotë Spec1lDTM096 që përfaqësojnë shprehjen Spec1l nga E8.5 në E10.5.NE = neuroektodermë, NF = palosje nervore, PA1 = harku i parë i faringut.(EP) SPECC1L imunosinifikimi me shënuesit NCC AP2A dhe SOX10 në palosjet nervore E8.5 (NF; EJ) dhe seksionet e kafkës E9.5 (KP).Ngjyrosja SPECC1L u vu re gjerësisht në palosjet nervore E8.5 (E, H; maja shigjetash), duke përfshirë qelizat e etiketuara me AP2A (F, G; maja shigjetash) dhe SOX10 (I, J; maja shigjetash).Në E9.5, SPECC1L me njolla të forta CNCC migruese (K, N; shigjeta) të etiketuara AP2A (L, M; shigjeta) dhe SOX10 (O, P; shigjeta).
Kryqëzimi midis minjve heterozigotë Spec1lDTM096/+ dhe Spec1lRRH048/+ tregon se dy alelet e kurthit të gjeneve nuk janë komplementare dhe se heterozigotët e përbërë dhe homozigotët embrionalë për secilin alel të kurthit të gjeneve janë vdekjeprurëse embrionale (Tabela S1).Raportet Mendeliane treguan një ulje të shkallës së mbijetesës së heterozigoteve në lindje (pritet 1,34 kundrejt 2,0).Ne vumë re vdekshmëri të ulët perinatale midis heterozigotëve, disa kishin anomali kraniofaciale (Fig. S3).Megjithatë, penetrenca e ulët e këtyre fenotipeve kraniofaciale perinatale e bën të vështirë studimin e mekanizmave të tyre patofiziologjikë themelorë.Prandaj, ne u përqëndruam në fenotipin vdekjeprurës embrional të mutantëve homozigotë Spec11.
Shumica e embrioneve mutante heterozigote ose homozigote Spec1lDTM096/RRH048 nuk u zhvilluan pas E9.5-10.5 (Fig. 5A-D) dhe tubi nervor nuk u mbyll përpara (Fig. 5B, D) dhe nganjëherë u mbyll prapa (nuk tregohet) ..Ky defekt i mbylljes së tubit nervor kranial u shoqërua me pjesën më të madhe të DLX2 të shënuar me CNCC që mbetën në palosjet nervore në E10.5, duke treguar se nuk ka diseksion (Figura 5A'-D').Për të përcaktuar nëse madhësia e përgjithshme e CNCC ishte zvogëluar gjithashtu, ne etiketuam linjat CNCC me GFP në linjat tona të kurthit të gjeneve me Wnt1-Cre dhe ROSAmTmG.Ne transmetuam GFP+ NCC dhe GFP- (RFP+) jo-NCC nga embrione të tëra.Në E9.5, përqindja e CNCC-ve të etiketuara me GFP të renditura me rrjedhë nuk ndryshoi ndjeshëm midis embrioneve WT dhe mutantë (nuk tregohet), duke treguar specifikimin normal të CNCC.Prandaj, ne supozuam se ngjyrosja e mbetur Wnt1-Cre dhe DLX2 në palosjet nervore të ekspozuara (Figura 5B') ishte për shkak të shtresimit të dëmtuar të CNCC, ndoshta për shkak të rritjes së densitetit ose shpërndarjes së qelizave AJ, siç shihet në qelizat SPECC1L-kd.Ne përdorëm shënuesit NCC SOX10, AP2A dhe DLX2 për të konfirmuar praninë e CNCC në palosjen nervore (Figura 5E-R).Në E8.5, ngjyrosja e palosjes nervore për të tre shënuesit NCC u vu re në seksionet e WT (Fig. 5E, G, I) dhe mutant Specc1l (Fig. 5F, H, J).Në E9.5, ndërsa shënuesit NCC ngjyrosnin NCC migruese në seksionet WT (Fig. 5M, O, Q), ngjyrosja e mbetur NCC u vu re në palosjet nervore të ekspozuara të embrioneve mutant Specc1l (Fig. 5N, P, R).Për shkak se SOX10 dhe DLX2 shënojnë CNCC-të migruese, ky rezultat sugjeron që CNCC-të me mangësi SPECC1L arrijnë specifikimin pas migrimit, por nuk arrijnë të migrojnë nga palosjet nervore.
Mungesa e specc11 çon në mbyllje të dëmtuar të tubit nervor, delaminim të qelizave të kreshtës nervore kraniale dhe AJ-ve.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrioni që mbart qelizat e kreshtit nervor kranial migrues (CNCC) të etiketuara me Wnt1-Cre (A').Në të kundërt, embrionet mutante Specc11 tregojnë palosje nervore të hapura (B), majat e shigjetave) dhe CNCC që nuk kanë migruar (B', majat e shigjetave).(C, D') Imazhet e fushës së ndritshme (C, D') dhe imuno-ngjyrosja (C', D') e shënuesit CNCC DLX2 të embrioneve E10.5 WT (C, C') dhe Spec1l (D, D').Në embrionet WT E10.5, CNCC DLX2-pozitive kolonizojnë harqet e gushës (C', shigjeta), ndërsa te mutantët, njollosja e dukshme vazhdon në palosjet e hapura nervore (D', shigjetat) dhe në harqet e para të faringut (D', shigjeta).) me disa njolla (shigjeta) që tregojnë delamination të dobët dhe migrim të CNCC.ER) Seksionet e embrioneve mutante WT dhe Spec1l në fazat E8.5 (E-L) dhe E9.5 (M-R) u etiketuan me shënuesit NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) dhe DLX2 (I, J, Q, R).Në E8.5, ngjyrosja NCC u vu re në palosjen nervore të tipit të egër (NF) dhe seksionet mutant.Bashkë-ngjyrosja e SOX10 dhe β-catenin në E8.5 WT (K) dhe mutant (L) zbuloi rritje të ngjyrosjes β-catenin në kufijtë e qelizave në palosjet nervore.Në E9.5, u vu re ngjyrosje e tipit të egër të CNCC-ve migruese (M, O, Q), ndërsa në mutantët, CNCC të pastratifikuara ngjyrosën palosje të hapura nervore (N, P, R).(S–Z) Analiza e etiketimit in vivo AJ në seksionet koronale të embrioneve WT dhe Spec11DTM096/RRH048 me mutacionin E9.5.Një plan i përafërt seksional tregohet në këndin e sipërm të djathtë.Në seksionet e indeve mutant, u vu re ngjyrosje e shtuar e F-aktinës (S, T) dhe miozinës IIb (U, V).Ngjashëm me rezultatet in vitro në Fig. 3, në embrionet mutante, u vu re ngjyrosje e përmirësuar e membranës për β-catenin (W, X) dhe E-kadherinë (Y, Z).(AA-BB) Një mikrograf elektronik i një seksioni të një embrioni të tipit të egër që shikon përtej kufirit të qelizës apikale-bazale tregon një rajon të veçantë të dendur elektronik që tregon lidhjet ngjitëse (AA, shigjeta).Në të kundërt, në seksionet e embrioneve mutante Specc11 (BB, shigjeta), i gjithë kryqëzimi apikobazal është i dendur me elektron, gjë që tregon një densitet dhe shpërndarje të shtuar të kryqëzimeve ngjitëse.
Për të testuar hipotezën tonë se shtresimi i reduktuar është për shkak të AJ të ndryshuar, ne ekzaminuam etiketimin e AJ në palosjet nervore të ekspozuara të embrioneve mutante Specc1l (Fig. 5S-Z).Ne vumë re një rritje të fibrave të stresit të aktinës (Fig. 5S, T) dhe një rritje shoqëruese të lokalizimit të ngjyrosjes së miozinës IIB në fibrat e aktinës (Fig. 5U, V).E rëndësishmja, ne kemi vërejtur rritje të ngjyrosjes së β-catenin (Fig. 5W, X) dhe E-kadherinë (Fig. 5Y, Z) në kufijtë ndërqelizor.Ne ekzaminuam gjithashtu ngjyrosjen me β-catenin të NCC në palosjet nervore të embrioneve E8.5 (Fig. 5K, L).Ngjyrosja me β-catenin duket të jetë më e fortë në palosjet nervore mutante Specc1l (Fig. 5L dhe K), duke sugjeruar që ndryshimet në AJ kishin filluar.Në mikrografitë elektronike të seksioneve të kafkës së embrioneve E9.5, ne përsëri vumë re një rritje të ngjyrosjes difuze me elektron të dendur në embrionet mutant Spec1l krahasuar me WT (Fig. 5AA, BB dhe S1E-H).Të marra së bashku, këto rezultate mbështesin rezultatet tona in vitro në qelizat SPECC1L-kd U2OS dhe sugjerojnë që ngjyrosja aberrante AJ i paraprin shtresimit CNCC në embrionet tona mutante.
Duke pasur parasysh marrëdhënien e njohur antagoniste midis aktivitetit të AKT dhe stabilitetit të E-kadherinës,17,28 ne hipotezuam përfshirjen e sinjalizimit PI3K-AKT.Përveç kësaj, ne vëzhguam flluska subepidermale në disa nga embrionet tona mutante që i shpëtuan vdekjes (<5%) në E9.5-10.5 dhe në vend të kësaj u vendosën në rreth E13.5 (Fig. S3).Vezikulat subepidermale janë një shenjë dalluese e sinjalizimit të reduktuar PI3K-AKT bazuar në PDGFRα12.Fantauzzo etj.(2014) raportoi se ndërprerja e aktivizimit të PI3K me bazë PDGFRα në embrionet mutante PdgfraPI3K/PI3K rezulton në vezikula subepidermale, defekte të tubit nervor dhe fenotipe të qiellzës së çarë.Në të vërtetë, nivelet e pan-AKT dhe Ser473-AKT aktive të fosforiluar u reduktuan in vivo në indet mutante Specc1l në ndalimin embrional E9.5 (Fig. 6A-D).Ulja e niveleve të Ser473-AKT të fosforiluar mund të jetë tërësisht për shkak të uljes së niveleve të pan-AKT in vivo (Fig. 6E) dhe in vitro (Fig. 6F).Një rënie in vitro u vu re vetëm kur qelizat U2OS ishin fort konfluente me ndryshimet në formën e qelizave dhe densitetin e AJ (Figura 6D).Kështu, të dhënat tona sugjerojnë se SPECC1L është një rregullator pozitiv i ri i sinjalizimit PI3K-AKT në morfogjenezën kraniofaciale.
(A-E) E8.5 (A,B) dhe E9.5 (C,D) seksione kafke ose lizate E9.5 nga embrionet mutante Specc1l (E) që tregojnë nivele të S473-AKT të fosforiluar aktive dhe reduktim të proteinave pan-AKT , krahasuar me kontrollin WT.Western blotting u krye në lizate të tipit të egër dhe lizate mutante në të njëjtat kushte.Imazhet e shfaqura për SPECC1L janë marrë nga një blot.E njëjta njollë u hoq dhe u riekzaminua me antitrupa anti-pan-ACT dhe β-aktinë.Nivelet e Pan-AKT në palosjet nervore E8.5 (A, B) dhe nivelet e S473-AKT të fosforiluar në seksionet e kafkës E9.5 u reduktuan ndjeshëm.(F) Nivelet e Pan-AKT u reduktuan në mënyrë të ngjashme në lizatet e qelizave SPECC1L-kd U2OS të mbledhura në konfluencë të lartë.Shiritat e gabimit përfaqësojnë SEM nga tre sasiore të pavarura Western blot.(GJ) Seksione të embrioneve WT në E9.5 të ngjyrosura me KI67 dhe kaspazë 3 të copëtuar, përkatësisht, duke treguar proliferim qelizor (G, G') dhe aktivitet të vogël apoptotik (H, H').Embrionet mutante Specc11 tregojnë proliferim të krahasueshëm qelizor (I), por numri i qelizave që i nënshtrohen apoptozës është rritur ndjeshëm (J).
Më pas kemi ekzaminuar shënuesit e proliferimit dhe apoptozës.Ne nuk kemi vërejtur ndonjë ndryshim në përhapjen e embrioneve E9.5 (Fig. 6E, G krahasuar me I) me një indeks përhapjeje prej 82.5% për mutantët WT dhe 86.5% për mutantët Spec1l të matur me ngjyrosjen KI67 (p <0.56, Fisher's test i saktë).Në mënyrë të ngjashme, ne nuk vërejtëm ndonjë ndryshim në apoptozën e matur me ngjyrosje për kaspazën 3 të copëtuar në palosjet nervore në E8.5 deri në ndalimin e embrionit (nuk tregohet) (nuk tregohet).Në të kundërt, apoptoza u rrit ndjeshëm në të gjitha embrionet mutante E9.5 (Fig. 6F, H dhe J).Kjo rritje e përgjithshme e apoptozës është në përputhje me sinjalizimin e reduktuar PI3K-AKT dhe vdekshmërinë e hershme embrionale29,30,31.
Më pas, për të konfirmuar një rol shkakësor për sinjalizimin PI3K-AKT në ndryshimet AJ në qelizat tona kd, ne ndryshuam kimikisht shtegun në qelizat e kontrollit dhe kd (Figura 7A-F).Ne përdorëm si shënues fenotipin e ndryshimit të formës së qelizës, i vërejtur në qelizat e bashkuara SPECC1L-kd, të cilin e përcaktuam duke përdorur raportin e dimensionit (gjatësisë) më të gjatë me dimensionin vertikal (gjerësinë) përkatëse.Një raport prej 1 pritet për qelizat relativisht të rrumbullakëta ose kuboidale (Figura 7G).Përveç formës së qelizës, ne konfirmuam edhe efektin në AJ me ngjyrosje me β-catenin (Fig. 7A'-F').Frenimi i rrugës PI3K-AKT duke përdorur wortmannin ishte i mjaftueshëm për të ndryshuar formën e qelizave në qelizat e kontrollit (Figura 7A,C) dhe AJ (Figura 7A').Aktivizuesi PI3K-AKT SC-79 nuk ndikoi në formën e qelizës (Fig. 7A, E) ose zgjerimin AJ (FIG. 7A') në qelizat e kontrollit.Në qelizat SPECC1L-kd, shtypja e mëtejshme e rrugës PI3K-AKT rezultoi në rritje të apoptozës (Fig. 7B, D) dhe një rritje të dukshme të ngjyrosjes së β-catenin (Fig. 7B'), në përputhje me mutantët tanë të rëndë in vivo.E rëndësishmja, aktivizimi i rrugës PI3K-AKT përmirësoi ndjeshëm formën e qelizave (Figura 7B, F) dhe fenotipet AJ (Figura 7B").Ndryshimet në formën e qelizës u përcaktuan si raporti i rrumbullakësisë së qelizave (CCR) dhe u krahasuan për rëndësinë siç përshkruhet më sipër (Fig. 7G).Në të vërtetë, në qelizat e kontrollit (Fig. 7G, CCR = 1.56), trajtimi me wortmannin ishte i mjaftueshëm për të ndryshuar ndjeshëm formën e qelizës (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) në masën e ngjashme me atë të vërejtur në SPECC1L.-qeliza kd (Fig. 7G, CCR = 3,46).Trajtimi me Wortmannin i qelizave SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, i papërfillshëm) nuk ishte më domethënës se qelizat kd të patrajtuara (Fig. 7G, CCR = 3.46, e papërfillshme) ose qelizat e kontrollit të trajtuara me wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3,46, i papërfillshëm) ndikon gjithashtu në zgjatjen e qelizave (7G, CCR = 3,61, i papërfillshëm).Më e rëndësishmja, aktivizuesi SC-79 AKT rivendosi fenotipin e zgjatur të qelizave SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Këto rezultate konfirmojnë se SPECC1L rregullon sinjalizimin PI3K-AKT dhe sugjerojnë që një rënie e moderuar e SPECC1L ndikon në ngjitjen e qelizave, ndërsa një rënie e fortë çon në apoptozë (Fig. 8).
(A–F') Qelizat e kontrollit (A, C, E) dhe SPECC1L-kd (B, D, F) të trajtuara me frenues të rrugës PI3K-AKT wortmannin (C, D) ose me aktivizues SC-79 (E, F) Trajtimi .Qelizat e kontrollit të patrajtuara janë kuboide (A) me ngjyrosje normale qelizore β-cat (A'), ndërsa qelizat kd janë të zgjatura (B) me ngjyrosje të rritur të β-cat (B').Pas shtypjes së rrugës PI3K-AKT, qelizat e kontrollit u zgjatën (C) me zgjerimin e β-cat (C'), ndërsa qelizat kd filluan t'i nënshtroheshin apoptozës (D), të ngjashme me embrionet tona shumë të mutuara dhe duke treguar β-cat jashtëzakonisht të përmirësuar.ngjyrosje (D').Pas aktivizimit të rrugës PI3K-AKT, qelizat e kontrollit mbetën kuboidale (E) dhe kishin ngjyrosje normale β-cat (E'), ndërsa qelizat kd treguan formë të përmirësuar të qelizave (F) dhe ngjyrosje β-cat (F'), gjë që tregon G.Qelizat e patrajtuara (NT) SPECC1L-kd (CCR = 3,46) ishin dukshëm më të gjata se qelizat e kontrollit (CCR = 1,56, p <6,1 × 10-13).Frenimi i Wort i rrugës PI3K-AKT në qelizat e kontrollit ishte i mjaftueshëm për të shkaktuar një zgjatje të ngjashme në formën e qelizave (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Në mënyrë të ngjashme, aktivizimi i AKT nga SC-79 në qelizat SPECC1L-kd rivendosi zgjatjen e qelizave në nivelet e kontrollit (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Trajtimi me Wortmannin i qelizave SPECC1L-kd rezultoi në rritje të apoptozës, por jo rritje të mëtejshme në ndryshimin e formës së qelizës (CCR=3.60) krahasuar me qelizat kontrolluese të patrajtuara kd (CCR=3.46, ns) ose të trajtuara me wortmannin (3.61) të vërejtura në.ns = nuk ka rëndësi.+/- Tregohen matjet SEM për 50 qeliza.Diferencat statistikore janë llogaritur duke përdorur T-testin Student.
(A) Paraqitja skematike e frenimit dhe aktivizimit të rrugës PI3K-AKT që rezulton në ndryshime dhe shpëtim AJ, respektivisht.(B) Modeli i propozuar për stabilizimin e proteinës AKT nga SPECC1L.
CNCC-të premigruese kërkojnë lizën AJ për t'u ndarë nga qelizat neuroepiteliale të palosjes nervore anteriore1,15,32.Rritja e ngjyrosjes së komponentëve AJ dhe humbja e shpërndarjes asimetrike AJ apikale-bazale në qelizat me mungesë SPECC1L si in vitro ashtu edhe in vivo, e kombinuar me afërsinë fizike të SPECC1L me β-catenin, sugjerojnë që SPECC1L funksionon për të ruajtur siç duhet stabilitetin lokal të AJ për muskujt e organizimit.citoskeleti i aktinës.Lidhja e SPECC1L me citoskeletin e aktinës dhe β-catenin dhe rritja e numrit të filamenteve të kondensuar të aktinës në mungesë të SPECC1L është në përputhje me rritjen e vërejtur në densitetin e AJ.Një mundësi tjetër është që një numër i shtuar i fibrave të aktinës në qelizat me mungesë SPECC1L çon në një ndryshim në tensionin ndërqelizor.Për shkak se stresi qelizor ndikon në dinamikën e AJ 33, ndryshimet e tensionit mund të rezultojnë në AJ 34 më të përhapur.Pra, çdo ndryshim do të ndikojë në shtresat CNCC.
Wnt1 shprehet në palosjet e hershme nervore që krijojnë qelizat e kreshtës nervore.Kështu, gjurmimi i linjës Wnt1-cre shënon NCC35 para dhe migrues.Megjithatë, Wnt1 shënon gjithashtu klone të indit dorsal të trurit që rrjedhin gjithashtu nga palosjet e hershme nervore 35,36, duke e bërë të mundshme që ngjyrosja jonë e mutantëve E9.5 për shënuesit Wnt1 në palosjet nervore të hapura nuk është CNCC.Ngjyrosja jonë pozitive për shënuesit NCC AP2A dhe SOX10 konfirmoi se palosjet nervore të ekspozuara të embrioneve mutante Specc11 përmbanin vërtet CNCC.Përveç kësaj, meqenëse AP2A dhe SOX10 janë shënues të NCC migratore të hershme, ngjyrosja pozitive tregoi se këto qeliza janë CNCC pas migrimit që nuk mund të shtresohen nga E9.5.
Të dhënat tona sugjerojnë se rregullimi molekular i AJ nga SPECC1L ndërmjetësohet nga sinjalizimi PI3K-AKT.Sinjalizimi AKT zvogëlohet në qelizat dhe indet me mungesë të SPECC1L.Gjetjet nga Fantauzzo et al.mbështesin një rol të drejtpërdrejtë për sinjalizimin PI3K-AKT në morfogjenezën kraniofaciale.(2014) tregoi se mungesa e aktivizimit të sinjalizimit PI3K-AKT me bazë PDGFRα çon në një fenotip të qiellzës së çarë.Ne tregojmë gjithashtu se frenimi i rrugës PI3K-AKT është i mjaftueshëm për të ndryshuar formën e AJ dhe qelizës në qelizat U2OS.Në përputhje me gjetjet tona, Cain et al.37 tregoi se rregullimi i poshtëm i nën-njësisë PI3K α110 në qelizat endoteliale rezulton në një rritje të ngjashme në ngjyrosjen perqelizore të β-cateninës, referuar si një rritje në "indeksin e lidhjes".Sidoqoftë, në qelizat endoteliale, filamentet e aktinës së të cilave tashmë janë shumë të organizuara, shtypja e rrugës PI3K-AKT rezulton në një formë të lirshme qelize.Në të kundërt, qelizat SPECC1L-kd U2OS treguan një formë qelize të zgjatur.Ky ndryshim mund të jetë specifik i llojit të qelizës.Ndërsa shtypja e sinjalizimit PI3K-AKT ndikon përgjithmonë në citoskeletin e aktinës, efekti në formën e qelizave përcaktohet nga ndryshimet në tension të shkaktuara nga ndryshimet në densitetin dhe organizimin e fibrave qendrore të aktinës.Në qelizat U2OS, ne përdorëm vetëm ndryshimet e formës së qelizës si një shënues të ndryshimit dhe rikuperimit të AJ me mungesë SPECC1L.Si përfundim, ne supozojmë se frenimi i rrugës AKT në mungesën e SPECC1L rrit stabilitetin e AJ dhe redukton delaminimin në CNCC.
Është interesante se nivelet e pan-AKT u reduktuan in vitro dhe in vivo përveç niveleve të fosforiluara 473-AKT në mungesë të SPECC1L, duke sugjeruar rregullimin e sinjalizimit PI3K-AKT në nivelin e stabilitetit ose qarkullimit të proteinës AKT.Gjenet SPECC1L dhe MID1, të dyja të lidhura me sindromën Opitz/GBBB, kodojnë proteinat që stabilizojnë mikrotubulat 18,22.Mekanizmi me të cilin SPECC1L dhe MID1 ndërmjetësojnë stabilizimin e mikrotubulave nuk është kuptuar plotësisht.Në rastin e SPECC1L, ky stabilizim përfshin acetilim të zgjeruar të një nëngrupi mikrotubulash 18 .Është e mundur që SPECC1L përdor një mekanizëm të ngjashëm për të stabilizuar proteinat e tjera si AKT.Është treguar se acetilimi i mbetjeve të lizinës në proteinën AKT çon në një ulje të lokalizimit të membranës dhe fosforilimit38.Përveç kësaj, ubiquitinimi i zinxhirit K63 në të njëjtën mbetje lizine në AKT kërkohet për lokalizimin dhe aktivizimin e tij membranor39,40.Midis disa faktorëve që ndërveprojnë me proteinat SPECC1L të identifikuar në ekrane të ndryshme me dy hibride maja me kapacitet të lartë, katër - CCDC841, ECM2942, APC dhe UBE2I43 - janë implikuar në qarkullimin ose stabilitetin e proteinave nëpërmjet ubiquitinimit ose sumoilimit.SPECC1L mund të përfshihet në modifikimin pas përkthimit të mbetjeve të lizinës AKT, duke ndikuar në stabilitetin e AKT.Megjithatë, roli kritik i SPECC1L në lokalizimin dhe stabilitetin e proteinës AKT mbetet për t'u sqaruar.
Defektet e rënda në shprehjen e SPECC1L in vivo rezultuan në rritje të ngjyrosjes së shënuesit AJ dhe mbivendosje të dëmtuar të CNCC, si dhe rritje të apoptozës dhe vdekjes së hershme embrionale.Raportet e mëparshme kanë treguar se mutantët e miut me nivele të rritura të apoptozës shoqërohen me defekte të tubit nervor 44,45,46,47 dhe defekte kraniofaciale48.Është sugjeruar që vdekja e tepërt e qelizave në palosjet nervore ose harqet e faringut mund të rezultojë në një numër të pamjaftueshëm të qelizave të nevojshme për lëvizjen e duhur morfogjenetike 48,49,50.Në të kundërt, linjat tona qelizore me mungesë të SPECC1L me shprehje të reduktuar mesatarisht të SPECC1L treguan vetëm ndryshime AJ pa dëshmi të rritjes së vdekjes së qelizave.Sidoqoftë, frenimi kimik i rrugës PI3K-AKT në këto qeliza Kd rezultoi në rritje të apoptozës.Kështu, një rënie e moderuar e shprehjes ose funksionit të SPECC1L siguron mbijetesën e qelizave.Kjo është në përputhje me vëzhgimin se embrionet e rralla mutante Spec11 që i shpëtojnë arrestimit në rr.E9.5 - ndoshta për shkak të reduktimit të efikasitetit të kapjes së gjeneve - janë në gjendje të mbyllin tubat e tyre nervorë dhe të ndalojnë më vonë në zhvillim, shpesh me defekte kraniofaciale (Fig. S3).Gjithashtu në përputhje me këtë është shfaqja e rrallë e embrioneve heterozigotë Spec1l me anomali kraniofaciale - ndoshta për shkak të rritjes së efikasitetit të kapjes së gjeneve - si dhe gjetja në zebrafish në të cilin një nga dy ortologët SPECC1L (specc1lb) shkakton humbje të vonshme embrionale, duke përfshirë humbjen e fenotipeve. nofullat e poshtme dhe çarjet bilaterale51.Kështu, mutacionet heterozigote të humbjes së funksionit të SPECC1L të identifikuara te pacientët njerëzorë mund të shkaktojnë dëmtime të vogla në funksionin e SPECC1L gjatë morfogjenezës kraniofaciale, të mjaftueshme për të shpjeguar çarjet e tyre orofaciale.Rregullimi i kontakteve ndërqelizore me bazë SPECC1L mund të luajë gjithashtu një rol në palatogjenezën dhe shkrirjen e harqeve të faringut.Studime të mëtejshme të funksionit SPECC1L do të ndihmojnë në sqarimin e rolit të kontakteve të përkohshme ndërqelizore në CNCC gjatë mbylljes së tubit nervor në lëvizshmërinë e qelizave neuroepiteliale dhe morfogjenezën kraniofaciale.
Kontrolli i osteosarkomës U2OS dhe qelizat SPECC1L-kd janë përshkruar më parë (Saadi et al., 2011).Antitrupat kundër SPECC1L janë karakterizuar gjithashtu më parë (Saadi et al., 2011).Antitrupat anti-β-catenin (lepuri; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (miu; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Kembrixh, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ) , KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), kaspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) dhe β-aktinë (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) u përdor siç përshkruhet..Filamentet e aktinës u ngjyrosën me rodamin phalloidin me njollë Acti (Cytoskeleton, Denver, Kolorado).
Qelizat e kontrollit U2OS dhe qelizat SPECC1L-kd u kultivuan në DMEM standarde me glukozë të lartë të plotësuar me 10% serum fetusi të gjedhit (Life Technologies, Carlsbad, CA).Për ndryshimet AJ, 2 x 105 qeliza u mbollën në xhami të trajtuar me 0.1% xhelatinë derri (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dhe u vëzhguan për ndryshime në formën e qelizave.Qelizat u mblodhën në pika të ndryshme kohore të treguara: 4 orë pas mbjelljes (t = 1), 24 orë pas mbjelljes (t = 2), bashkim pa ndryshim në formën e qelizës (t = 3), ndryshim në formën e qelizës (t = 4) , 24 orë pas ndryshimit të formës së qelizës (t = 5) dhe 48 orë pas ndryshimit të formës së qelizës (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Për të modifikuar rrugën PI3K-AKT, qelizat u kultivuan në përqendrimet e treguara me frenuesin PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ose aktivizuesin SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minesota).Mjeti që përmbante kimikatet ndryshohej çdo ditë.
Regjistrimet kornizë për kornizë u bënë në kontrollin e drejtpërdrejtë dhe qelizat KD në kushte normale të kulturës dhe imazhet e kontrastit fazor u mblodhën çdo 10 minuta për 7 ditë.Imazhet u morën duke përdorur një mikroskop të përmbysur Leica DM IRB të kontrolluar nga kompjuteri i pajisur me një skenë mekanike dhe një objektiv 10 × N-PLAN të lidhur me një kamerë QImaging Retiga-SRV.Gjatë imazherisë, kulturat qelizore u mbajtën në 37°C në një atmosferë të lagësht me 5% CO2.
Dy linja qelizore të kurthit të gjeneve ES DTM096 dhe RRH048 nga Qendra Rajonale e Burimeve të Miut Mutant (UC Davis, CA) u përdorën për të gjeneruar linja miu me mangësi Specc11, të përcaktuara Specc1lgtDTM096 dhe Spec1lgtRRH046.Shkurtimisht, qelizat 129/REJ ES u injektuan në blastocist C57BL6.Minjtë meshkuj kimerik që rezultuan u edukuan me minj femra C57BL6 për të identifikuar pasardhësit me ngjyrosjen e veshjes agouti.Prania e inserteve të vektorit të kurthit të gjeneve u përdor për të identifikuar heterozigotët.Minjtë u mbajtën në një sfond të përzier 129/REJ;C57BL6.Vendndodhja e vendit të futjes së vektorit të kurthit gjenetik u konfirmua nga RT-PCR, sekuenca e gjenomit dhe plotësimi gjenetik (Figura plotësuese 1).Për të gjurmuar linjën CNCC të minjve të dyfishtë heterozigotë Spec1lGT, minjtë ROSAmTmG (#007576) dhe Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) u kryqëzuan për të prodhuar ROSAmTmG dhe WntTmG incccC allemutrel1-.Të gjitha eksperimentet në minj u kryen sipas protokolleve të miratuara nga Komiteti Institucional i Kujdesit dhe Përdorimit të Kafshëve të Qendrës Mjekësore të Universitetit të Kansasit.
Embrionet u fiksuan në (1% formaldehid, 0,2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) për 60 minuta në temperaturën e dhomës.Pas fiksimit në solucionin e ngjyrosjes X-gal (5 mM ferricyanid kaliumi, 5 mM ferrocianid kaliumi, 2 mM MgCl2, 0.01% deoksikolat natriumi, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Zhvillimi i njollës u krye në 37°C .°C brenda 1-6 orëve.Embrionet u fiksuan në 4% PFA dhe u vizualizuan.
Për Western blotting, qelizat u lizuan në tampon lize pasive (Promega, Fitchburg, WI) të plotësuar me një përzierje të frenuesve të proteazës HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizat u përpunuan në xhel të gatshëm 12% poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) dhe u transferuan në membranat Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranat u bllokuan në qumësht 5% në PBS që përmban 0.1% Tween.Antitrupat u inkubuan gjatë natës në 4°C ose për një orë në temperaturën e dhomës.Reagenti Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) u përdor për gjenerimin e sinjalit.Për imuno-ngjyrosjen, embrionet u fiksuan brenda natës në 4% PFA/PBS dhe u kriopservuan.Krioseksionet e indeve u bllokuan në PBS që përmbante 1% serum normal dhie (Thermo Scientific, Waltham, MA) dhe 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dhe më pas u inkubuan në 4°C në një inkubator gjatë natën.me anti-antitrup dhe antitrup sekondar fluoreshent (1:1000) për 1 orë në 4°C.Seksionet e ngjyrosura u vendosën në medium ari ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) dhe imazhet e sheshta u morën duke përdorur një mikroskop konfokal Leica TCS SPE.Çdo imuno-ngjyrosje u krye si tre eksperimente të pavarura në cirosseksionet e të paktën dy embrioneve mutante.Tregohet një eksperiment përfaqësues.
Qelizat u inkubuan në tampon RIPA të modifikuar (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerinë, 2 mM EDTA dhe frenues i proteazës HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Shkurtimisht, lizatet u parapastruan me rruaza magnetike të proteinës G (Life Technologies, Carlsbad, CA) dhe më pas u inkubuan gjatë natës në 4° C. me rruaza proteine ​​G anti-SPECC1L ose IgG u përdorën për nxjerrjen e SPECC1L dhe Western blotting u krye duke përdorur anti. Antitrupi -β-catenin i përshkruar më sipër Eksperimentet co-IP të treguara janë përfaqësuese të katër eksperimenteve të pavarura.
Qelizat e kultivuara të fiksuara ose indet embrionale të miut iu dhanë qendrës së mikroskopisë elektronike në Qendrën Mjekësore të Universitetit të Kansasit.Shkurtimisht, mostrat u futën në rrëshirë EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), u polimerizuan gjatë natës në 60°C dhe u ndanë në 80 nm duke përdorur një ultramikrotomë Leica UC7 të pajisur me një teh diamanti.Seksionet u vizualizuan duke përdorur një mikroskop elektronik transmetimi JEOL JEM-1400 të pajisur me një armë Lab6 100 kV.
Si të citoni këtë artikull: Wilson, NR et al.Mungesa e SPECC1L çon në rritjen e stabilitetit të nyjeve të bashkuara dhe zvogëlimin e delaminimit të qelizave të kreshtës nervore kraniale.shkenca.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksioni dhe diferencimi i kreshtit nervor.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Qelizat e kreshtës nervore kraniale në lëvizje: roli i tyre në zhvillimin kraniofacial.Gazeta Amerikane e Gjenetikës Mjekësore.Pjesa A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: rritja dhe zhvillimi i saj gjatë 20 viteve.Pediatër.patologji.laboratori.bar.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU dhe Noten MM Përparim në gjenetikën e çarjeve orofaciale.Trendet në Mjekësinë Molekulare 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. dhe Riley, FM Mekanizmat molekularë të migrimit dhe modelimit të qelizave të kreshtës nervore kraniale gjatë zhvillimit kraniofacial.Zhvillimi 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH dhe Murray, JK Cleft lip and alate: kuptimi i ndikimeve gjenetike dhe mjedisore.koment natyral.Genetics 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfogjeneza jonormale e lëkurës, gjymtyrëve dhe rajonit kraniofacial në minjtë me mungesë të faktorit-6 (Irf6) që rregullon interferonin.Genette Kombëtare.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutacionet dominante në GRHL3 shkaktojnë sindromën van der Waord dhe dëmtojnë zhvillimin e peridermës orale.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ dhe Juriloff, DM Përditësoni listën e mutantëve të miut me defekte në mbylljen e tubit nervor dhe përparoni drejt një kuptimi të plotë gjenetik të mbylljes së tubit nervor.Hetimi i defekteve të lindjes.Pjesa A, Teratologjia Klinike dhe Molekulare 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Sinjalizimi PDGFRalfa i ndërmjetësuar nga PI3K rregullon mbijetesën dhe përhapjen në zhvillimin e skeletit përmes një rruge ndërqelizore të varur nga p53.Zhvillimi i Gjenit 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND dhe Murdoch, JN Disheveled: Lidhja e zgjerimit konvergjent me mbylljen e tubit nervor.Tendencat në neurologji.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).