347 Tub me mbështjellje 12,7*1,24 mm, mekanizëm molekular i kondensimit elektrostatik sinkron dhe bashkimit të α-sinukleinës dhe tau

Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Rrëshqitës që tregojnë tre artikuj për rrëshqitje.Përdorni butonat e pasëm dhe të ardhshëm për të lëvizur nëpër rrëshqitje, ose butonat e kontrolluesit të rrëshqitjes në fund për të lëvizur nëpër secilën rrëshqitje.

347 Specifikimi i tubave prej çeliku inox

347 Tub me mbështjellje 12,7*1,24mm inox

Diametri i jashtëm: 6,00 mm OD deri në 914,4 mm OD, Madhësitë deri në 24” NB disponohen Ex-stock, OD Size Tuba çeliku disponohen Ex-stock

Gama e trashësisë së tubit SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etj. (0.5-12mm) Ose madhësia jo e rregullt për t'u përshtatur sipas nevojës

Lloji: SS 347 Tuba pa tegel |Tuba SS 347 ERW |Tuba të salduar SS 347 |Tuba të fabrikuar SS 347 |Tuba CDW SS 347, tuba LSAW / të salduara me tegel / rivizatuar

Forma: Tuba/ Tuba të rrumbullakëta SS 347, Tuba/ Tuba katrorë SS 347, Tuba/ Tuba drejtkëndëshe SS 347, Tuba me mbështjellje SS 347, Formë SS 347 “U”, SS 347 mbështjellje për kek tepsi, Tuba hidraulikë SS 347

Gjatësia: E vetme e rastësishme, e dyfishtë e rastësishme dhe fundi i gjatësisë së kërkuar: fund i thjeshtë, fund i pjerrët, i shkelur

Mbrojtja e fundit: Kapele plastike |Mbarimi i jashtëm: 2B, Nr.4, Nr.1, Nr.8 Mbarimi i pasqyrës për tuba çeliku inox, Finish sipas kërkesave të klientit

Kushtet e dorëzimit: Pjekja dhe turshi, e lëmuar, e pjekur e ndritshme, e tërhequr në të ftohtë

Inspektimi, raportet e provës: Certifikatat e provës së mullirit, EN 10204 3.1, raportet kimike, raportet mekanike, raportet e testit PMI, Raportet e inspektimit vizual, raportet e inspektimit të palëve të treta, raportet e laboratorit të miratuar nga NABL, raportet e testit shkatërrues, raportet e testit jo shkatërrues

Paketimi: Paketuar në kuti druri, qese plastike, shirita çeliku të paketuara ose sipas kërkesave të klientëve

Speciale: Madhësitë dhe specifikimet e ndryshme nga ato të mësipërme mund të prodhohen sipas kërkesës

Gama e madhësisë së tubit SS 347: 1/2 inç NB, OD deri në 24 inç

ASTM A312 347: Tub austenitik i salduar pa tegel dhe me tegel të drejtë, i destinuar për temperaturë të lartë dhe shërbim të përgjithshëm gërryes.Metali mbushës nuk lejohet gjatë saldimit.

ASTM A358 347: Tub austenitik i salduar me shkrirje elektrike për shërbim gërryes dhe/ose temperaturë të lartë.Në mënyrë tipike, vetëm tubat deri në 8 inç prodhohen sipas këtij specifikimi.Shtimi i metalit mbushës lejohet gjatë saldimit.

ASTM A790 347: Tub ferritik/austenitik (duplex) i salduar pa tegel dhe me tegel të drejtë, i destinuar për shërbime të përgjithshme korrozive, me një theks të veçantë në rezistencën ndaj plasaritjes nga korrozioni i stresit.

ASTM A409 347: Tub elektrik austenitik me mur të lehtë me diametër të madh të salduar me bashkim të drejtë ose me tegel spirale në madhësi 14” deri në 30” me mure Sch5S dhe Sch 10S për gërryerje dhe/ose të larta

ASTM A376 347: Tub austenitik pa tela për aplikime në temperaturë të lartë.

ASTM A813 347: Tub austenitik me një shtresë, një ose dy saldim për temperatura të larta dhe aplikime të përgjithshme korrozive.

ASTM A814 347: Tub austenitik i salduar i punuar në të ftohtë për temperaturë të lartë dhe shërbim të përgjithshëm korroziv.

347H Përbërja kimike e tubave prej çeliku inox

Vetitë mekanike të tubit prej çeliku inox 347H

Vetitë fizike të tubave inox 347H

Notat ekuivalente për tubin inox 347H

Grumbullimi i alfa-sinukleinës amiloide (αS) është një shenjë dalluese e sëmundjes së Parkinsonit dhe sinukleinopative të tjera.Kohët e fundit, proteina tau e lidhur zakonisht me sëmundjen e Alzheimerit është lidhur me patologjinë αS dhe është gjetur se bashkë-lokalizohet në përfshirje të pasura me αS, megjithëse mekanizmi molekular i koagregimit të dy proteinave mbetet i paqartë.Ne raportojmë këtu se faza αS ndahet në kondensata të lëngshme nëpërmjet kondensimit kompleks elektrostatik me polipeptide të ngarkuar pozitivisht si tau.Në varësi të afinitetit të αS për polikacionet dhe shkallës së zbrazjes së valencës së rrjetit të koagulimit, mpiksjet i nënshtrohen xhelatimit ose bashkimit të shpejtë të ndjekur nga grumbullimi i ngadaltë i amiloidit.Duke kombinuar një sërë teknikash të avancuara biofizike, ne ishim në gjendje të karakterizonim ndarjen e fazës αS/Tau lëng-lëng dhe të identifikonim faktorët kryesorë që çojnë në formimin e agregateve heterogjene që përmbajnë të dyja proteinat në një kondensatë proteinike të lëngshme.
Përveç ndarjeve të membranës, ndarja hapësinore në qeliza mund të arrihet gjithashtu me formimin e trupave të dendur të pasur me proteina, të ngjashme me lëngjet, të quajtura kondensata ose pika biomolekulare, përmes një procesi të njohur si ndarja e fazës së lëngshme-lëngshme (LLPS).Këto pika formohen nga ndërveprimet kohore shumëvalente, zakonisht midis proteinave ose proteinave dhe ARN-së dhe shërbejnë një sërë funksionesh në pothuajse të gjitha sistemet e gjalla.Një numër i madh i proteinave të aftë për LLP shfaqin sekuenca me kompleksitet të ulët që janë shumë të çrregullta në natyrë dhe në formimin e kondensateve biomolekulare3,4,5.Studime të shumta eksperimentale kanë zbuluar natyrën fleksibël, shpesh të çrregullt dhe shumëvalente të proteinave që përbëjnë këto kondensata të ngjashme me lëngun, megjithëse dihet pak për përcaktuesit specifikë molekularë që kontrollojnë rritjen dhe maturimin e këtyre kondensatave në një formë më të ngurtë. shteti..
Të dhënat e reja mbështesin hipotezën se LLPS aberrante e drejtuar nga proteina dhe transformimi i pikave në struktura të ngurta mund të jenë rrugët qelizore të rëndësishme që çojnë në formimin e agregateve toksike të patretshme që shpesh janë shenja dalluese të sëmundjeve degjenerative.Shumë proteina të çrregulluara të brendshme të lidhura me LLPS (IDP), shpesh shumë të ngarkuara dhe fleksibël, janë shoqëruar prej kohësh me neurodegjenerimin përmes procesit të grumbullimit të amiloidit.Në veçanti, kondensatat biomolekulare të IDP si FUS7 ose TDP-438 ose proteinat me domene të mëdha kompleksiteti të ulët si hnRNPA19 janë treguar se plaken në forma të ngjashme me xhel apo edhe të ngurta përmes një procesi të quajtur fluidizim.kompleks.në tranzicionin e fazës së ngurtë (LSPT) në funksion të kohës ose në përgjigje të disa modifikimeve post-përkthimore ose mutacioneve patologjikisht të rëndësishme1,7.
Një tjetër IDP i lidhur me LLPS in vivo është Tau, një proteinë e çrregulluar e lidhur me mikrotubulat, grumbullimi amiloide i së cilës është implikuar në sëmundjen e Alzheimerit10, por kohët e fundit është implikuar edhe në sëmundjen e Parkinsonit (PD) dhe proteinopati të tjera sinaptike bërthamore 11, 12, 13.Tau është treguar se shkëputet spontanisht nga tretësira/citoplazma për shkak të ndërveprimeve të favorshme elektrostatike14, duke rezultuar në formimin e pikave të pasuruara me tau të njohura si koacervate elektrostatike.Është vënë re gjithashtu se ky lloj ndërveprimi jo specifik është forca shtytëse pas shumë kondensateve biomolekulare në natyrë15.Në rastin e një proteine ​​tau, agregimi elektrostatik mund të formohet nga grumbullimi i thjeshtë, në të cilin rajonet e ngarkuara në mënyrë të kundërt të proteinës shkaktojnë procesin e ndarjes, ose nga grumbullimi kompleks përmes ndërveprimit me polimerët e ngarkuar negativisht si ARN.
Kohët e fundit, α-sinukleina (αS), një IDP amiloid i implikuar në PD dhe sëmundje të tjera neurodegjenerative të njohura kolektivisht si sinukleinopatia17,18, është demonstruar në modelet qelizore dhe shtazore19,20 e përqendruar në kondensatat e proteinave me sjellje të ngjashme me lëngun.Studimet in vitro kanë treguar se αS i nënshtrohet LLPS me agregim të thjeshtë nëpërmjet ndërveprimeve kryesisht hidrofobike, megjithëse ky proces kërkon përqëndrime jashtëzakonisht të larta të proteinave dhe kohë inkubimi atipike të gjata19,21.Nëse kondensatat që përmbajnë αS të vëzhguara in vivo formohen nga ky ose procese të tjera LLPS, mbetet një çështje kryesore e pazgjidhur.Në mënyrë të ngjashme, megjithëse grumbullimi i amiloidit αS është vërejtur në neuronet në PD dhe sinukleinopatitë e tjera, mekanizmi i saktë me të cilin αS i nënshtrohet grumbullimit të amiloidit ndërqelizor mbetet i paqartë, pasi mbishprehja e kësaj proteine ​​nuk duket se e shkakton vetë këtë proces.Shpesh kërkohet dëmtim shtesë qelizor, duke sugjeruar se nevojiten lokacione ose mikromjedise të caktuara qelizore për ribërthamimin e asambleve amiloide αS ndërqelizore.Një mjedis qelizor që është veçanërisht i prirur ndaj grumbullimit mund të jetë brendësia e kondensatave të proteinave 23 .
Është interesante se αS dhe tau janë gjetur të bashkëlokalizohen në përfshirjet karakteristike të sëmundjes tek njerëzit me sëmundjen e Parkinsonit dhe sinukleinopatitë e tjera 24,25 dhe eksperimentet kanë raportuar një marrëdhënie patologjike sinergjike midis dy proteinave 26,27 që sugjeron një lidhje të mundshme midis grumbullimit αS dhe tau në sëmundjet neurodegjenerative.sëmundje.U zbulua se αS dhe tau ndërveprojnë dhe nxisin grumbullimin e njëri-tjetrit in vitro dhe in vivo 28,29 dhe agregate heterogjene të përbëra nga këto dy proteina janë vërejtur në trurin e pacientëve me sinukleinopati 30 .Megjithatë, dihet pak për bazën molekulare të ndërveprimit midis αS dhe tau dhe mekanizmin e bashkë-agregimit të tij.Është raportuar se αS ndërvepron me tau përmes një tërheqjeje elektrostatike midis rajonit C-terminal të ngarkuar shumë negativisht të αS dhe rajonit qendror të pasur me prolinë të tau, i cili gjithashtu është i pasuruar me mbetje të ngarkuara pozitivisht.
Në këtë studim, ne tregojmë se αS me të vërtetë mund të shpërndahet në pika nëpërmjet kondensimit kompleks elektrostatik në prani të proteinës tau, në kontrast me ndërveprimin e tij me polipeptide të tjerë të ngarkuar pozitivisht si poli-L-lizina (pLK) dhe në këtë proces .αS vepron si një molekulë skele për rrjetin e pikave.Ne kemi identifikuar dallime të dukshme në procesin e maturimit të koacervateve elektrostatike αS, të cilat shoqërohen me ndryshime në valencën dhe forcën e ndërveprimit të proteinave të përfshira në rrjetin koacervat.Interesante, ne vëzhguam bashkë-agregimin e proteinave amiloide αS dhe tau në koacervate të lëngshme jetëgjata dhe identifikuam disa faktorë kyç që çojnë në bashkë-agregimin e këtyre dy proteinave në koacervate të tilla.Këtu ne përshkruajmë në detaje këtë proces, i cili është një mekanizëm i mundshëm molekular që qëndron në themel të kolokalizimit të dy proteinave në përfshirjet specifike të sëmundjes.
αS ka një bisht C-terminal shumë anionik në pH neutral (Fig. 1a), dhe ne supozuam se mund t'i nënshtrohet LLPS përmes kondensimit të komplekseve elektrostatike me molekula polipeptide të çrregullta polikationike.Ne përdorëm një poli-L-lizinë me 100 mbetje (pLK) si molekulën e modelit fillestar për shkak të natyrës së saj polimerike të ngarkuar pozitivisht dhe të çrregullt në pH neutral 32. Së pari, ne konfirmuam se pLK ndërvepron me domenin Ct të αS nëpërmjet spektroskopisë NMR Solution (Figura 1b) duke përdorur αS të etiketuar me 13C/15N në prani të rritjes së raporteve molare αS:pLK.Ndërveprimi i pLK me domenin Ct të αS manifestohet në shqetësime të zhvendosjes kimike dhe një ulje të intensitetit të pikut në këtë rajon të proteinës.Është interesante, kur përziem αS me pLK në një përqendrim αS prej përafërsisht.5–25 μM në prani të polietilen glikolit (5–15% PEG-8) (bufer tipik LLPS: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ne menjëherë kaluam nëpër një fushë të gjerë të formimit të proteinave .pikat u vëzhguan duke përdorur mikroskopin me fluoreshencë (WF) dhe me fushë të ndritshme (BF) (Fig. 1c).Pikat 1-5 μm që përmbajnë αS të koncentruar (të shtuara 1 μM αS, AF488-αS të etiketuar me AlexaFluor488), vetitë e tyre elektrostatike mund të rrjedhin nga rezistenca e tyre ndaj 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) dhe ndjeshmëria e tij ndaj një rritje në përqendrimin e NaCl (Fig. 1c).Natyra e ngjashme me lëngun e koacervateve të kompleksit elektrostatik αS/pLK demonstrohet nga aftësia e tyre për t'u shkrirë brenda milisekondave (Fig. 1d).Duke përdorur turbidimetrinë, ne përcaktuam sasinë e formimit të pikave në këto kushte, konfirmuam natyrën elektrostatike të ndërveprimit kryesor të lidhur me stabilitetin e tij (Fig. 1e) dhe vlerësuam efektin e raporteve të ndryshme të polimerit në procesin LLPS (Fig. 1f).Megjithëse formimi i pikave vërehet në një gamë të gjerë raportesh polimeresh, procesi është shumë i favorshëm kur pLK është më i madh se αS.LLP-të janë vërejtur gjithashtu duke përdorur agjentin kimikisht të ndryshëm zhvendosës dekstran-70 (70 kDa) ose duke përdorur një shumëllojshmëri formatesh mostrash, duke përfshirë pikat e rrëshqitjes së qelqit, puse mikropllake të materialeve të ndryshme, kapilarët Eppendorf ose kuarc.
një paraqitje skematike e rajoneve të ndryshme të proteinave në variantet WT-αS dhe ΔCt-αS të përdorura në këtë studim.Domeni amfipatik N-terminal, rajoni hidrofobik i formimit të amiloidit (NAC) dhe domeni C-terminal i ngarkuar negativisht janë treguar përkatësisht me ngjyrë blu, portokalli dhe të kuqe.Është paraqitur harta e tarifës neto për mbetje (NCPR) të WT-αS.b Analiza NMR e ndërveprimit αS/pLK në mungesë të grumbullimeve makromolekulare.Ndërsa përqendrimi i pLK rritet (raportet molare αS:pLK prej 1:0.5, 1:1.5 dhe 1:10 tregohen respektivisht me jeshile të hapur, jeshile dhe jeshile të errët).c Coacervate αS/pLK (raporti molar 1:10) në 25 μM (1 μM αS e etiketuar me AF488 ose pLK e etiketuar me Atto647N për imazhe me WF) në tampon LLPS (lart) ose plotësuar me 500 mM NaCl (poshtë majtas) ose pas 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; poshtë djathtas).Shiriti i shkallës = 20 µm.d Imazhe mikroskopike përfaqësuese të shkrirjes së pikave BF të αS/pLK (raporti molar 1:10) në një përqendrim 25 μM;shigjetat tregojnë bashkimin e pikave individuale (shigjetat e kuqe dhe të verdha) në një pikë të re (shigjeta portokalli) brenda 200 ms) .Shiriti i shkallës = 20 µm.e Shpërndarja e dritës (në 350 nm) agregimi αS/pLK në tampon LLPS para dhe pas shtimit të 500 mM NaCl ose 10% 1,6-HD në 25 μM αS (N = 3 përsëritje të mostrës, mesatarja dhe devijimi standard tregohet gjithashtu).f imazhi BF (lart) dhe analiza e shpërndarjes së dritës (në 350 nm, fundi) e grumbullimit αS/pLK në 25 μM αS me raport molar në rritje αS:pLK (N = 3 përsëritje të mostrës, mesatarja dhe devijimi standard i treguar gjithashtu).Shiriti i shkallës = 10 µm.Shiriti i shkallës në një imazh tregon shkallën e të gjitha imazheve në një panel.Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.
Bazuar në vëzhgimet tona të kondensimit të kompleksit elektrostatik αS/pLK dhe vëzhgimeve të mëparshme të αS si një molekulë kliente e kondensatës tau/ARN përmes ndërveprimit të drejtpërdrejtë me tau31, ne supozuam se αS dhe tau mund të bashkëndahen me tretësin në mungesë të ARN. kondensimi.përmes komplekseve elektrostatike, dhe αS është proteina e skelës në coacervates αS/Tau (shih shpërndarjen e ngarkesës tau në figurën 2e).Ne vumë re se kur 10 μM αS dhe 10 μM Tau441 (që përmban 1 μM AF488-αS dhe 1 μM Atto647N-Tau, përkatësisht) u përzien së bashku në tampon LLPS, ata formuan lehtësisht agregate proteinash që përmbajnë të dyja proteinat, siç shihet nga mikroskopi WF.(Fig. 2a).Kolokalizimi i dy proteinave në pikat u konfirmua me mikroskopi konfokale (CF) (Figura plotësuese 1a).Sjellje e ngjashme u vërejt kur dekstrani-70 u përdor si një agjent grumbullimi (Fig. Suplementare 1c).Duke përdorur PEG ose dekstran të etiketuar me FITC, ne zbuluam se të dy agjentët e grumbullimit u shpërndanë në mënyrë të barabartë nëpër mostra, duke mos treguar as ndarje dhe as shoqërim (Figura suplementare 1d).Përkundrazi, sugjeron që në këtë sistem ato nxisin ndarjen e fazave përmes efekteve të grumbullimit makromolekulare, pasi PEG është një agjent grumbullimi preferencialisht i qëndrueshëm, siç shihet në sistemet e tjera LLP33,34.Këto pika të pasura me proteina ishin të ndjeshme ndaj NaCl (1 M) por jo ndaj 1,6-HD (10% v/v), duke konfirmuar vetitë e tyre elektrostatike (Figura plotësuese 2a, b).Sjellja e tyre e lëngjeve u konfirmua duke vëzhguar ngjarjet e pikave të shkrirjes milisekonda duke përdorur mikroskopin BF (Fig. 2b).
Një imazhe me mikroskop konfokal (CF) të αS/Tau441 bashkohen në tampon LLPS (10 μM të secilës proteinë, 0,5 μM të αS të etiketuar me AF488 dhe Tau441 të etiketuar me Atto647N).b Imazhet përfaqësuese të kontrastit të ndërhyrjes diferenciale (DIC) të ngjarjeve të shkrirjes së pikave αS/Tau441 (10 μM për secilën proteinë).c Diagrami i fazës i bazuar në shpërndarjen e dritës (në 350 nm) të Tau441 LLPS (0–15 µM) në mungesë (majtas) ose pranisë (djathtas) të 50 µM αS.Ngjyrat më të ngrohta tregojnë më shumë shpërndarje.d Shpërndarja e dritës e mostrave αS/Tau441 LLPS me përqendrim në rritje të αS (Tau441 në 5 µM, N = 2–3 përsëritje të mostrës siç tregohet).Paraqitja skematike e disa varianteve të proteinës tau dhe rajoneve të ndryshme të proteinës së përdorur në këtë studim: domeni N-terminal i ngarkuar negativisht (e kuqe), rajoni i pasur me prolinë (blu), domeni lidhës me mikrotubulat (MTBD, i theksuar në portokalli) dhe spirale çift formues amiloid.rajonet e filamentit (PHF) të vendosura brenda MTBD (gri).Është paraqitur harta e tarifës neto për mbetje (NCPR) të Tau441.f Duke përdorur αS të etiketuar me 1 μM AF488 dhe ΔNt- të etiketuar me Atto647N, duke përdorur αS ose ΔCt-αS të etiketuar me 1 μM AF488 në prani të ΔNt-Tau (lart, 10 μM për proteinë) ose K18 (poshtë, 50 μM për proteinë ) ) ) mikrografë të WF të kondensuar në tampon LLPS ose K18.Shiritat e shkallës në një imazh përfaqësojnë shkallën e të gjitha imazheve në një panel (20 µm për panelet a, b dhe f).Të dhënat e papërpunuara për panelet c dhe d ofrohen si skedarë të të dhënave të papërpunuara.
Për të testuar rolin e αS në këtë proces LLPS, ne fillimisht hetuam efektin e αS në stabilitetin e pikave me anë të nefelometrisë duke përdorur përqendrimet në rritje të NaCl (Fig. 2c).Sa më i lartë të jetë përqendrimi i kripës në mostrat që përmbajnë αS, aq më të larta janë vlerat e shpërndarjes së dritës (në 350 nm), gjë që tregon rolin stabilizues të αS në këtë sistem LLPS.Një efekt i ngjashëm mund të vërehet duke rritur përqendrimin αS (dhe rrjedhimisht raportin αS:Tau441) në përafërsisht.10-fish rritje në lidhje me përqendrimin e tau (5 µM) (Fig. 2d).Për të demonstruar se αS është një proteinë skele në coacervates, ne vendosëm të hetojmë sjelljen e mutantit Tau të ndërprerë nga LLPS, të cilit i mungon një rajon N-terminal i ngarkuar negativisht (mbetjet 1-150, shih Fig. 2e) të quajtur ΔNt-Tau.Mikroskopi WF dhe nefelometria konfirmuan se vetë ΔNt-Tau nuk iu nënshtrua LLPS (Fig. 2f dhe Fig. Suplementare 2d), siç u raportua më parë 14. Megjithatë, kur αS iu shtua zgjidhjeve dispersioni të këtij varianti të cunguar Tau, procesi LLPS ishte plotësisht restauruar me densitet të pikave afër densitetit të pikave të tretësirave me madhësi të plotë të Tau dhe αS në kushte të ngjashme dhe përqendrime proteinash.Ky proces mund të vërehet edhe në kushtet e grumbullimit të ulët makromolekular (Fig. Suplementar 2c).Roli i rajonit αS të terminalit C, por jo i gjithë gjatësisë së tij, në procesin e LLPS u demonstrua nga frenimi i formimit të pikave duke përdorur një variant αS të cunguar në terminalin C, të cilit i mungojnë mbetjet 104-140 (Fig. 1a) të (ΔCt- αS) proteina (Fig. 2f dhe Fig. Suplementare 2d).Kolokalizimi i αS dhe ΔNt-Tau u konfirmua nga mikroskopi fluoreshent konfokal (Figura suplementare 1b).
Për të testuar më tej mekanizmin LLPS midis Tau441 dhe αS, u përdor një variant shtesë Tau, përkatësisht fragmenti i çiftuar i bërthamës së filamentit spirale (PHF) në domenin e lidhjes së mikrotubulave (MTBD), i cili nëse përmban katër domene karakteristike të përsëritjes, zakonisht i njohur gjithashtu. si fragmenti K18 (shih Fig. 2e).Kohët e fundit është raportuar se αS lidhet në mënyrë preferenciale me një proteinë tau të vendosur në një domen të pasur me prolinë në një sekuencë që i paraprin domenit të lidhjes së mikrotubulave.Megjithatë, rajoni PHF është gjithashtu i pasur me mbetje të ngarkuara pozitivisht (shih Figurën 2e), veçanërisht lizinën (15% mbetje), gjë që na shtyu të testojmë nëse ky rajon gjithashtu kontribuon në kondensimin e kompleksit αS/Tau.Ne vumë re se vetëm K18 nuk mund të shkaktonte LLPS në përqendrime deri në 100 μM në kushtet e testuara (tampon LLPS me 15% PEG ose 20% dekstran) (Figura 2f).Megjithatë, kur shtuam 50 μM αS në 50 μM K18, formimi i shpejtë i pikave të proteinave që përmbajnë K18 dhe αS u vu re nga nefelometria (Fig. 2d plotësuese) dhe mikroskopi WF (Fig. 2f).Siç pritej, ΔCt-αS nuk ishte në gjendje të rivendoste sjelljen LLPS të K18 (Fig. 2f).Vëmë re se grumbullimi αS/K18 kërkon përqendrime pak më të larta të proteinave për të nxitur LLPS në krahasim me αS/ΔNt-Tau ose αS/Tau441, gjërat e tjera janë të barabarta.Kjo është në përputhje me një ndërveprim më të fortë të rajonit aS C-terminal me domenin Tau të pasur me prolinë në krahasim me domenin lidhës me mikrotubula, siç përshkruhet më parë 31 .
Duke pasur parasysh se ΔNt-Tau nuk mund të kryejë LLPS në mungesë të αS, ne zgjodhëm këtë variant Tau si një model për karakterizimin e αS/Tau LLPS duke pasur parasysh thjeshtësinë e tij në sistemet LLPS me Tau me gjatësi të plotë (izotipi, Tau441/Tau441).me procese grumbullimi komplekse (heterotipike, αS/Tau441).Ne krahasuam shkallën e grumbullimit αS (si pjesë e proteinës së fazës së kondensuar, fαS,c) në sistemet αS/Tau dhe αS/ΔNt-Tau me anë të centrifugimit dhe analizës SDS-PAGE të fazës së shpërndarë (shih 2e), gjetëm vlera shumë të ngjashme për të gjitha proteinat në të njëjtin përqendrim.Në veçanti, kemi marrë fαS,c 84 ± 2% dhe 79 ± 7% për αS/Tau dhe αS/ΔNt-Tau, përkatësisht, duke sugjeruar që ndërveprimi heterotipik midis αS dhe tau është më i lartë se ndërveprimi midis molekulave tau.ndërmjet.
Ndërveprimi me polikacione të ndryshme dhe efekti i procesit të kondensimit në kinetikën αS u studiuan fillimisht me metodën e rikuperimit të fluoreshencës pas fotozbardhimit (FRAP).Ne testuam coacervates αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau dhe αS/pLK (100 μM αS plotësuar me 2 μM αS AF488-αS dhe 100 μM Tau441 ose ΔNt-Tau ose 1 mM pLK).Të dhënat u morën brenda 30 minutave të para pas përzierjes së përbërësve të mostrës.Nga imazhet përfaqësuese të FRAP (Fig. 3a, kondensimi αS/Tau441) dhe kurbat e tyre përkatëse të rrjedhës kohore (Fig. 3b, Fig. Suplementare 3), mund të shihet se kinetika αS është shumë e ngjashme me ato të koacervateve Tau441.dhe ΔNt-Tau, i cili është shumë më i shpejtë me pLK.Koeficientët e llogaritur të difuzionit për αS brenda koacervatit sipas FRAP (siç përshkruhet nga Kang et al. 35) janë D = 0,013 ± 0,009 µm2/s dhe D = 0,026 ± 0,008 µm2/s për αS/Tau441 dhe αS/ sistemi αS/.pLK, Tau dhe D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, përkatësisht (Fig. 3c).Megjithatë, koeficienti i difuzionit αS në fazën e shpërndarë është disa rend magnitudë më i lartë se të gjitha fazat e kondensuar, siç përcaktohet nga spektroskopia e korrelacionit të fluoreshencës (FCS, shih Fig. 3 plotësuese) në të njëjtat kushte (tampon LLPS), por në mungesë të polikacioneve (D = 8 ± 4 µm2/s).Prandaj, kinetika e përkthimit të αS është reduktuar ndjeshëm në koacervate në krahasim me proteinat në fazën e shpërndarë për shkak të efekteve të theksuara të grumbullimit molekular, megjithëse të gjitha koacervatet ruajnë veti të ngjashme me lëngun gjatë gjysmës së parë pas formimit të tyre, në kontrast me fazën tau.kinetika më e shpejtë në kondensat pLK.
Analiza a-c FRAP e dinamikës αS (2% αS e etiketuar me AF488) në koacervatet elektrostatike.Imazhet përfaqësuese të analizave αS/Tau441 FRAP në tre kopje janë paraqitur në (a), ku rrathët e kuq tregojnë zona të çngjyrosura.Shiriti i shkallës është 5 µm.b Lakoret mesatare të FRAP dhe (c) koeficientët e llogaritur të difuzionit (D) për 5–6 (N) pika të ndryshme nga tre eksperimente duke përdorur 100 μM αS dhe përqendrime ekuimolare të Tau441 (e kuqe) ose ΔNt-Tau (blu) ose pLK (jeshile) në dhjetëfishin e përqendrimit të LLPS.Devijimi standard i kurbës FRAP tregohet me ngjyrë të hijezuar.Për krahasim, koeficienti i difuzionit αS në fazën e shpërndarë u përcaktua në tre kopje duke përdorur spektroskopinë e korrelacionit fluoreshent (FCS) (shih Figurën 3 plotësuese dhe metodat për më shumë informacion).d Spektrat EPR të brezit X të vazhdueshëm prej 100 μM TEMPOL-122-αS në tampon LLPS pa ndonjë polikacion (i zi) ose në prani të 100 μM Tau441 (e kuqe) ose ΔNt-Tau (blu) ose 1 mM pLK (jeshile).Futja tregon një pamje të zmadhuar të linjave të forta të fushës ku ndodhin ndryshimet më dramatike.e Lakoret lidhëse prej 50 μM TEMPOL-122-αS me polikacione të ndryshme në mungesë të LLPS (pa PEG).Amplituda e reduktuar e brezit III në krahasim me brezin II (IIII/III) të spektrit të normalizuar EPR tregohet se rrit raportet molare të Tau441 (e kuqe), ΔNt-Tau (blu) dhe pLK (jeshile).Vijat me ngjyra tregojnë përshtatjen me të dhënat duke përdorur një model të përafërt lidhës me n vende lidhëse identike dhe të pavarura në secilën kurbë.Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.
Si plotësues, ne hetuam dinamikën e αS në coacervate të ndryshme duke përdorur etiketimin e rrotullimit të drejtuar (SDSL) dhe rezonancën e vazhdueshme paramagnetike të elektroneve (CW-EPR).Kjo metodë është dëshmuar të jetë shumë e dobishme në raportimin e fleksibilitetit dhe dinamikës së PZHBV-së me një rezolutë realiste të mbetur36,37,38.Për këtë qëllim, ne ndërtuam mbetjet e cisteinës në mutantët e vetëm Cys dhe përdorëm sondën spin 4-hidroksi-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oksil (TEMPOL).Derivatet e maleimidit i etiketojnë ato.Më konkretisht, ne futëm sondat TEMPOL në pozicionin 122 ose 24 αS (TEMPOL-122-αS dhe TEMPOL-24-αS).Në rastin e parë, ne synojmë rajonin C-terminal të proteinës, i cili është i përfshirë në ndërveprim me polikacionet.Në vend të kësaj, pozicioni 24 mund të na japë informacion në lidhje me dinamikën e përgjithshme të proteinave në kondensat.Në të dyja rastet, sinjalet EPR të marra për proteinat e fazës së shpërndarë korrespondonin me radikalet e nitrooksidit në gjendjen e lëvizjes së shpejtë.Pas ndarjes së fazës në prani të tau ose pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ose ΔNt-Tau në një raport 1:1 ose pLK në një raport 1:10), u vu re një rritje në intensitetin e pikut relativ në spektri EPR i αS.Linja e humbjes u zgjerua, duke treguar kinetikë të reduktuar të riorientimit αS në pika në krahasim me proteinën në fazën e holluar (Fig. 3d, Fig. suplementare 4a).Këto ndryshime janë më të theksuara në pozicionin 122. Ndërsa në pozicionin 24 prania e pLK nuk ndikoi në kinetikën e sondës, në pozicionin 122 forma e vijës spektrale ndryshoi ndjeshëm (Fig. suplementare 4a).Kur u përpoqëm të modelonim spektrat në pozicionin 122 të dy sistemeve αS/polikacioni duke përdorur modelin izotropik (Figura plotësuese 5a) që përdoret zakonisht për të përshkruar dinamikën e IDP38,39 të etiketuar me spin, ne nuk ishim në gjendje të rindërtonim spektrat eksperimentale..Simulimi spektral i pozicionit të kontrasteve me 24 rrotullime (Fig. 5a plotësuese).Kjo sugjeron që ka pozicione preferenciale në hapësirën e konfigurimeve të rrotullimit të rajonit C-terminal të αS në prani të polikacioneve.Kur merret në konsideratë fraksioni i αS në fazën e kondensuar në kushte eksperimentale EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% dhe 47 ± 4% për αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau dhe αS/pLK, respektivisht — shih Suplementin Fig. 2e e analizës së të dhënave c), mund të shihet se zgjerimi i zbuluar me metodën EPR pasqyron kryesisht ndërveprimin e rajonit C-terminal të αS me polikacione të ndryshme në fazën e kondensuar (ndryshimi kryesor kur përdoret TEMPOL-122- αS), dhe jo kondensimi i proteinave.Në sondë vërehet një rritje e mikroviskozitetit.Siç pritej, spektri EPR i proteinës në kushte të ndryshme nga LLPS u rivendos plotësisht kur përzierjes iu shtua 1 M NaCl (Figura plotësuese 4b).Në përgjithësi, të dhënat tona sugjerojnë që ndryshimet e zbuluara nga CW-EPR kryesisht pasqyrojnë ndërveprimin e rajonit C-terminal të αS me polikacione të ndryshme në fazën e kondensuar, dhe ky ndërveprim duket të jetë më i fortë me pLK sesa me Tau.
Për të marrë më shumë informacion strukturor rreth proteinave në koacervat, vendosëm të studiojmë sistemin LLPS duke përdorur NMR në tretësirë.Sidoqoftë, ne mund të zbulonim vetëm fraksionin αS që mbetet në fazën e shpërndarë, e cila mund të jetë për shkak të dinamikës së reduktuar të proteinave brenda koacervatit dhe një faze të dendur në fund të zgjidhjes në analizën NMR.Kur analizuam strukturën dhe dinamikën e proteinës së mbetur në fazën e shpërndarë të kampionit LLPS duke përdorur NMR (Fig. Suplementare 5c, d), vumë re se proteina u soll pothuajse identike në prani të pLK dhe ΔNt-Tau, të dyja të cilat ishin në strukturën dytësore dhe dinamikën e shtyllës kurrizore të proteinës, të zbuluar nga eksperimentet mbi zhvendosjen kimike sekondare dhe relaksimin R1ρ.Të dhënat NMR tregojnë se fundi C i αS pëson një humbje të konsiderueshme të fleksibilitetit konformativ duke ruajtur natyrën e tij të çrregullt, si pjesa tjetër e sekuencës së proteinave, për shkak të ndërveprimeve të tij me polikacionet.
Meqenëse zgjerimi i sinjalit CW-EPR i vërejtur në fazën e kondensuar TEMPOL-122-αS pasqyron ndërveprimin e proteinës me polikacionet, ne kryem një titrim EPR për të vlerësuar afinitetin lidhës të αS me polikacione të ndryshme në mungesë të LLPS (pa akumulim të Buffer LLPS), duke sugjeruar që ndërveprimet janë të njëjta në fazat e holluara dhe të përqendruara (gjë që konfirmohet nga të dhënat tona, Fig. Suplementare 4a dhe Fig. Suplementare 6).Qëllimi ishte të shihej nëse të gjitha coacervatet, pavarësisht nga vetitë e tyre të zakonshme të ngjashme me lëngun, shfaqin ndonjë sjellje diferenciale në nivelin molekular.Siç pritej, spektri EPR u zgjerua me rritjen e përqendrimit të polikationit, duke reflektuar një ulje të fleksibilitetit molekular për shkak të ndërveprimeve molekulare të të gjithë partnerëve të ndërveprimit pothuajse deri në ngopje (Fig. 3e, Fig. 6 plotësuese).pLK e arriti këtë ngopje në një raport molar më të ulët (polikacioni: αS) krahasuar me ΔNt-Tau dhe Tau441.Në fakt, krahasimi i të dhënave me një model lidhjeje të përafërt duke supozuar n vende lidhëse identike dhe të pavarura tregoi se konstanta e dukshme e disociimit të pLK (~ 5 μM) është një renditje e madhësisë më e ulët se ajo e Tau441 ose ΔNt-Tau (~ 50 μM ).μM).Megjithëse ky është një vlerësim i përafërt, kjo sugjeron që αS ka një prirje më të lartë për polikacionet më të thjeshta me rajone të vazhdueshme të ngarkesës pozitive.Duke pasur parasysh këtë ndryshim në afinitet midis αS dhe polikacioneve të ndryshme, ne supozuam se vetitë e tyre të lëngshme mund të ndryshojnë ndryshe me kalimin e kohës dhe kështu të vuajnë nga procese të ndryshme LSPT.
Duke pasur parasysh mjedisin shumë të mbushur me njerëz brenda koacervatit të proteinës dhe natyrën amiloide të proteinës, ne vëzhguam sjelljen e koacervatit me kalimin e kohës për të zbuluar proceset e mundshme të LSPT.Duke përdorur mikroskopin BF dhe CF (Figura 4), ne vumë re se αS/Tau441 bashkohet në një masë të madhe në tretësirë, duke formuar pika të mëdha që kontaktojnë dhe lagojnë sipërfaqen në fund të pusit/rrëshqiten si pika të plota, siç pritej (Fig suplementar 7d);ne i quajmë këto struktura të formuara nga fundi "raft proteinash".Këto struktura mbetën të lëngshme pasi ruajtën aftësinë për t'u bashkuar (Fig. 7b plotësues) dhe mund të shiheshin për disa orë pasi LLPS u ndez (Fig. 4 dhe Fig. 7c plotësues).Ne vumë re se procesi i njomjes favorizohet në sipërfaqen e materialeve hidrofile dhe jo hidrofobike (Fig. 7a plotësuese), siç pritej për koacervatet elektrostatike me ngarkesa të pabalancuara dhe si rrjedhojë potenciale të larta elektrostatike sipërfaqësore.Veçanërisht, bashkimi αS/ΔNt-Tau dhe rafting u reduktuan ndjeshëm, ndërsa kondensatat αS/pLK u reduktuan ndjeshëm (Fig. 4).Gjatë kohës së shkurtër të inkubacionit, pikat αS/pLK ishin në gjendje të bashkoheshin dhe të lagnin sipërfaqen hidrofile, por ky proces u ndal shpejt dhe pas 5 orësh inkubimi, u vërejtën vetëm ngjarje të kufizuara bashkimi dhe nuk u vunë re lagështim.– kalim xhel-pikim.
Përfaqësues BF (panele në shkallë gri) dhe CF (panele djathtas, αS etiketuar me AF488 në të gjelbër) të mostrave të bashkuara që përmbajnë 100 μM αS (1% etiketë fluoreshente) në tampon LLPS në prani të 100 μM Tau441 (imazhe të sipërme) fluoreshencë ΔNt. -Tau (në qendër) ose 1 mM pLK (poshtë) në kohë të ndryshme inkubimi dhe lartësi fokale (z, distanca nga fundi i pusit të pllakës).Eksperimentet u përsëritën 4-6 herë në mënyrë të pavarur nga njëri-tjetri me të njëjtat rezultate.Koacervatat αS/Tau441 lagen pas 24 orësh, duke formuar gomone më të mëdha se imazhi.Shiriti i shkallës për të gjitha imazhet është 20 µm.
Më pas pyetëm nëse grupet e mëdha të proteinave të ngjashme me lëngun e formuar në αS/Tau441 LLPS do të çonin në grumbullimin e amiloidit të ndonjë prej proteinave të studiuara.Ne ndoqëm maturimin e pikave αS/Tau441 me kalimin e kohës me mikroskopin WF në të njëjtat kushte si më sipër, por duke përdorur αS të etiketuar me AF488 me 1 μM dhe Tau441 të etiketuar me Atto647N (Fig. 5a).Siç pritej, ne vëzhguam lokalizimin e plotë të proteinave gjatë gjithë procesit të maturimit.Interesante, nga rreth.Pas 5 orësh, brenda gomave u vunë re struktura jo rrethore më intensive, të cilat i quajtëm “pika”, disa prej të cilave u kolokalizuan me αS, dhe disa u pasuruan në Tau441 (Fig. 5a, shigjeta të bardha).Këto pika janë vërejtur gjithmonë brenda gomave në një masë më të madhe për αS/ΔNt-Tau sesa për αS/ΔNt-Tau.Nuk kishte pika të dallueshme në pikat e sistemeve pLK dhe Tau të paaftë për shkrirje/lagosje.Për të testuar nëse këto njolla që përmbajnë αS dhe Tau441 janë agregate të ngjashme me amiloidin, ne kryem një eksperiment të ngjashëm duke përdorur mikroskopin CF në të cilin Tau441 u etiketua me Atto647N dhe 12.5 μM thioflavin-T (ThT) specifike për amiloidin u shtua që në fillim.bojë.Megjithëse ngjyrosja me ThT e pikave ose gomave αS/Tau441 nuk u vu re as pas 24 orësh inkubimi (Fig. 5b, rreshti i sipërm - pikat e mbetura mbi gomonen proteinike), strukturat ThT-pozitive që përmbajnë Atto647N-Tau441 brenda gomones ishin shumë të dobëta.kjo përsërit madhësinë, formën dhe vendndodhjen e njollave të përshkruara më parë (Fig. 5b, rreshtat e mesit dhe të poshtëm), duke sugjeruar se njollat ​​mund të korrespondojnë me agregatet e ngjashme me amiloidin e formuar në koacervatet e lëngut të plakjes.
WF 25 μM αS në kohë të ndryshme inkubimi dhe lartësi fokale (z, distanca nga fundi i palidhur) në prani të 25 μM Tau441 (1 μM αS të etiketuar me AF488 dhe Tau441 të etiketuar me Atto647N) në një pus të një pllake mikroskopi me tampon LLPS) .Gjashtë eksperimente u përsëritën në mënyrë të pavarur me rezultate të ngjashme.b Imazhi mikroskopik CF i 25 μM αS në prani të 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-etiketuar Tau441) dhe 12,5 μM tioflavin-T (ThT).Pikat e peshuara të proteinave dhe gomat dhe pikat e proteinave të depozituara tregohen përkatësisht në rreshtat e sipërm dhe të mesëm.Rreshti i poshtëm tregon imazhe të gomave dhe pikave nga 3 kopje të pavarura.Shigjetat e bardha tregojnë pika ThT pozitive në të dy panelet.Shiriti i shkallës për të gjitha imazhet është 20 µm.
Për të shqyrtuar në mënyrë më të detajuar ndryshimet në rrjetin e proteinave të koacervatit gjatë kalimit nga lëngu në të ngurtë, ne përdorëm imazhin e jetës fluoreshence (FLIM) dhe mikroskopin e transferimit të energjisë me rezonancë Förster (FRET) (Figura 6 dhe figurat plotësuese 8 dhe 9).Ne supozuam se maturimi i bashkuar i shtresës në një strukturë proteine ​​të agreguar më të kondensuar apo edhe të ngurtë çon në kontakt më të ngushtë midis proteinës dhe sondës fluoreshente të lidhur me të, duke prodhuar potencialisht një efekt shuarjeje të manifestuar në një jetëgjatësi të shkurtuar të sondës (τ) , siç u përshkrua më parë40.,41 ,42.Për më tepër, për mostrat e etiketuara të dyfishta (AF488 dhe Atto647N si ngjyra dhuruese dhe pranuese FRET, përkatësisht), kjo rënie në τ mund të shoqërohet gjithashtu me kondensim koacervat dhe një rritje në efikasitetin FRET(E) gjatë LSPT.Ne monitoruam formimin e trapeve dhe pikave me kalimin e kohës në mostrat LLPS αS/Tau441 dhe αS/ΔNt-Tau (25 μM të secilës proteinë në tampon LLPS që përmban 1 μM AF488 të etiketuar αS dhe/ose Atto647N të etiketuar Tau441 ose ΔNt-Tau).Ne vëzhguam një prirje të përgjithshme në atë që jetëgjatësia e fluoreshencës së sondave AF488 (τ488) dhe Atto647N (τ647N) u ul paksa ndërsa coacervates maturoheshin (Fig. 6 dhe Fig. Suplementare 8c).Interesante, ky ndryshim u rrit ndjeshëm për pikat brenda gomave (Fig. 6c), duke treguar se kondensimi i mëtejshëm i proteinave ndodhi në pika.Në mbështetje të kësaj, nuk u vu re asnjë ndryshim domethënës në jetëgjatësinë e fluoreshencës për pikat αS/ΔNt-Tau të moshës për 24 orë (Fig. 8d plotësuese), duke sugjeruar që xhelatimi i pikave është një proces i dallueshëm nga njolla dhe që nuk shoqërohet me riorganizim të rëndësishëm molekular brenda coacervates.Duhet të theksohet se pikat kanë madhësi të ndryshme dhe përmbajtje të ndryshueshme në αS, veçanërisht për sistemin αS/Tau441 (Figura plotësuese 8e).Rënia në jetëgjatësinë e fluoreshencës me pika u shoqërua me një rritje të intensitetit, veçanërisht për Atto647N të etiketuar Tau441 (Fig. 8a shtesë) dhe efikasitet më të lartë FRET për të dy sistemet αS/Tau441 dhe αS/ΔNt-Tau, duke treguar kondensim të mëtejshëm në pesë orë LLPS pas ndezjes, proteinat brenda elektricitetit statik u kondensuan.Krahasuar me αS/ΔNt-Tau, kemi vërejtur vlera më të ulëta τ647N dhe disi më të larta τ488 në pikat αS/Tau441, të shoqëruara me vlera FRET më të ulëta dhe më johomogjene.Ndoshta, kjo mund të lidhet me faktin se në sistemin αS/Tau441, bollëku i αS i vëzhguar dhe i pritshëm në agregate është më heterogjen, shpesh substoikiometrik në krahasim me Tau, pasi vetë Tau441 mund t'i nënshtrohet gjithashtu LLPS dhe agregimit (Figura plotësuese 8e) .Sidoqoftë, shkalla e bashkimit të pikave, formimi i trapeve dhe, më e rëndësishmja, grumbullimi i proteinave brenda koacervateve të ngjashme me lëngun është maksimale kur janë të pranishëm të dy Tau441 dhe αS.
një imazhe me mikroskop fluoreshent gjatë gjithë jetës (FLIM) të αS/Tau441 dhe αS/ΔNt-Tau në 25 μM të secilës proteinë (1 μM αS të etiketuar me AF488 dhe 1 μM të etiketuar me Atto647N Tau441 ose ΔNt-Tau) në tampon LLPS.Kolonat tregojnë imazhe përfaqësuese të mostrave LLPS në kohë të ndryshme maturimi (30 min, 5 orë dhe 24 orë).Korniza e kuqe tregon rajonin që përmban pika αS/Tau441.Jetëgjatësia tregohet si shirita me ngjyra.Shiriti i shkallës = 20 µm për të gjitha imazhet.b Imazhi FLIM i zmadhuar i zonës së zgjedhur, i paraqitur në kutinë e kuqe në panelin a.Diapazoni i jetëgjatësisë tregohet duke përdorur të njëjtën shkallë ngjyrash si në panelin a.Shiriti i shkallës = 5 µm.c Histogramet që tregojnë AF488 (bashkëngjitur me αS) ose Atto647N (bashkëngjitur me Tau) për lloje të ndryshme proteinash (pika-D-, trap-R- dhe speckle-P) të identifikuara në imazhet FLIM të regjistruara për αS-) shpërndarjet e kohës së jetës së Tau441 dhe Mostrat e bashkuara αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI për D, 29-44 ROI për R dhe 21-51 ROI për pikat).Vlerat mesatare dhe mesatare tregohen respektivisht si katrorë të verdhë dhe vija të zeza brenda kutive.Kufijtë e poshtëm dhe të sipërm të kutisë përfaqësojnë përkatësisht kuartilin e parë dhe të tretë, dhe vlerat minimale dhe maksimale brenda diapazonit 1,5-fish të interkuartilit (IQR) tregohen si mustaqe.Pjesa e jashtme tregohet si diamante të zezë.Rëndësia statistikore midis çifteve të shpërndarjeve u përcaktua duke përdorur një T-test me dy mostra, duke supozuar variancat e pabarabarta.Vlerat p të testit t t dyfishtë tregohen me yllza për çdo çift të dhënash të krahasuara (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns Tregon neglizhencë (p-value > 0.05).Vlerat e sakta p jepen në tabelën plotësuese 1, dhe të dhënat origjinale paraqiten si skedarë të të dhënave të papërpunuara.
Për të demonstruar më tej natyrën e ngjashme me amiloidin e njollave/agregateve, ne trajtuam mostrat e koacervateve të panjollosura për 24 orë me përqendrime të larta të (1 M) NaCl, gjë që rezultoi në ndarjen e agregateve nga koacervatet e proteinave.Kur agregatet e izoluar (dmth., një zgjidhje e shpërndarë agregatesh) u vëzhguan duke përdorur mikroskopin e forcës atomike (AFM), ne vëzhguam një morfologji kryesisht sferike me një lartësi të rregullt prej rreth 15 nm, e cila tenton të shoqërohet në kushte të përqendrimit të lartë të kripës, e ngjashme me sjellja e fibrileve tipike amiloide për shkak të efektit të fortë hidrofobik në sipërfaqe (vini re se fibrilet zakonisht kanë një lartësi prej ~ 10 nm) (Figura plotësuese 10a).Është interesante se kur agregatët e izoluar u inkubuan me ThT në një analizë standarde të fluoreshencës ThT, ne vumë re një rritje dramatike në rendimentin kuantik të fluoreshencës ThT, të krahasueshme me atë të vërejtur kur boja u inkubua me fibrile tipike amiloide αS (Figura plotësuese 10b), duke sugjeruar se 10b. agregatet koacervat përmbajnë struktura të ngjashme me amiloide..Në fakt, agregatet ishin tolerantë ndaj përqendrimeve të larta të kripës, por të ndjeshme ndaj klorurit 4 M guanidine (GdnHCl), si fibrilet tipike amiloide (Fig. Suplementare 10c).
Më pas, ne analizuam përbërjen e agregateve duke përdorur fluoreshencën me një molekulë, korrelacionin specifik të fluoreshencës / spektroskopinë e korrelacionit të kryqëzuar (FCS/FCCS) dhe analizën e shpërthimit të zbulimit të rastësisë me dy ngjyra (TCCD).Për këtë qëllim, ne izoluam agregate të formuar pas 24 orësh inkubimi në 100 μl mostra LLPS që përmbajnë αS dhe Tau441 (të dyja 25 μM) së bashku me 1 μM αS të etiketuar me AF488 dhe 1 μM të etiketuar me Atto647N Tau441.Holloni tretësirën e shpërndarë të agregatit që rezulton në një gjendje monomolekulare duke përdorur të njëjtin tampon pa PEG dhe 1 M NaCl (i njëjti tampon që përdoret për të ndarë agregatet nga koacervati) për të parandaluar çdo ndërveprim të mundshëm elektrostatik midis LLPS dhe proteinës.Një shembull i trajektores kohore të një molekule të vetme mund të shihet në Fig. 7a.Analiza FCCS/FCS (ndër-korrelacioni, CC dhe autokorrelacioni, AC) tregoi se agregatet që përmbajnë αS dhe tau ishin të bollshme në mostra (shih kurbën CC në Fig. 7b, paneli majtas) dhe një tepricë e proteinës monomerike të mbetur u shfaq si një rezultat i procesit të hollimit (shih kthesat AC në figurën 7b, paneli majtas).Eksperimentet e kontrollit të kryera në të njëjtat kushte solucioni duke përdorur mostra që përmbajnë vetëm proteina monomerike nuk treguan kurba CC dhe kurbat AC përshtaten mirë me modelin e difuzionit me një komponent (Eq. 4), ku proteinat monomerike kanë koeficientët e pritur të difuzionit (Fig. 7b ), paneli i djathtë).Koeficienti i difuzionit të grimcave të grumbulluara është më pak se 1 µm2/s dhe ai i proteinave monomerike është rreth 1 µm2/s.50-100 µm/s;vlerat janë të ngjashme me vlerat e publikuara më parë për fibrilet amiloide αS të sonikuara dhe αS monomere veçmas në kushte të ngjashme tretësire44.Kur analizuam agregatët me analizën e shpërthimit TCCD (Fig. 7c, paneli i sipërm), zbuluam se në çdo agregat të izoluar (heteroagregat αS/Tau), rreth 60% e agregatëve të zbuluar përmbanin si αS ashtu edhe tau, rreth 30% përmbanin vetëm tau, vetëm rreth 10% αS.Analiza stoikiometrike e heteroagregateve αS/Tau tregoi se shumica e heteroagregateve ishin pasuruar me tau (stoikometria nën 0.5, numri mesatar i molekulave tau për agregat është 4 herë më shumë se molekulat αS), gjë që është në përputhje me punën tonë të vëzhguar në FLIM in situ eksperimente..Analiza FRET tregoi se këto agregate përmbanin të dyja proteinat, megjithëse vlerat aktuale të FRET në këtë rast nuk kanë një rëndësi të madhe, pasi shpërndarja e fluoroforeve në secilin agregat ishte e rastësishme për shkak të një tepricë të proteinës së paetiketuar të përdorur në eksperiment.Interesante, kur kryenim të njëjtën analizë duke përdorur variantin Tau me mungesë të grumbullimit të amiloidit të pjekur 45,46 (shih Fig. Suplementare 11a,b), vumë re se megjithëse grumbullimi elektrostatik αS ishte i njëjtë (Figura plotësuese 11c, d), aftësia për të formuar agregate brenda koacervatit u zvogëlua në mënyrë drastike dhe FLIM zbuloi disa pika në eksperimentet in situ dhe u vërejtën kthesa të dobëta të ndërlidhjes për mostrat agregate të izoluara.Megjithatë, për një numër të vogël të agregateve të zbuluar (vetëm një e dhjeta e Tau441), ne vumë re se çdo agregat ishte pasuruar në αS sesa ky variant Tau, me afërsisht 50% të agregateve të zbuluara që përmbajnë vetëm molekula αS, dhe αS ishte heterogjene në tepricë. .agregatet (shih Fig. Suplementare 11e), ndryshe nga agregatet heterogjene të krijuara nga Tau441 (Fig. 6f).Rezultatet e këtyre eksperimenteve treguan se megjithëse vetë αS është në gjendje të grumbullohet me tau brenda koacervatit, bërthamimi i tau është më i favorshëm në këto kushte dhe agregatet e ngjashme me amiloidin që rezultojnë janë në gjendje të veprojnë si një formë e αS dhe tau.Megjithatë, sapo të formohet një bërthamë e pasur me tau, ndërveprimet heterotipike ndërmjet αS dhe tau janë të favorizuara në agregate mbi ndërveprimet homotipike ndërmjet molekulave tau;vëzhgojmë edhe rrjetet proteinike në koacervatet e lëngëta αS/tau.
a Gjurmët kohore me fluoreshencë përfaqësuese të molekulave të vetme të agregateve të izoluara të formuara në koacervatet elektrostatike αS/Tau441.Shpërthimet që korrespondojnë me koagregatët αS/Tau441 (shpërthime mbi pragun e treguar) u vunë re në tre kanale zbulimi (emetimi AF488 dhe Atto647N pas ngacmimit të drejtpërdrejtë, vijat blu dhe të kuqe, emetimi Atto647N pas ngacmimit indirekt), FRET, vija vjollce).b Analiza FCS/FCCS e një kampioni të agregateve të izoluar αS/Tau441 të marra nga LLPS (paneli i majtë).Lakoret e autokorrelacionit (AC) për AF488 dhe Atto647N tregohen përkatësisht me ngjyrë blu dhe të kuqe, dhe lakoret e ndërlidhjes (CC) të lidhura me agregatët që përmbajnë të dyja ngjyrat tregohen me ngjyrë vjollce.Lakoret AC pasqyrojnë praninë e llojeve të proteinave të etiketuara monomerike dhe të agreguara, ndërsa kurbat CC tregojnë vetëm difuzionin e agregateve të dyfishtë të etiketuar.E njëjta analizë, por në të njëjtat kushte zgjidhjeje si në pikat e izoluara, mostrat që përmbajnë vetëm αS monomerike dhe Tau441 tregohen si kontrolle në panelin e djathtë.c Analizë fluoreshence me blic të molekulave të vetme të agregateve të izoluara të formuara në koacervatet elektrostatike αS/Tau441.Informacioni për secilin agregat të gjetur në katër përsëritje të ndryshme (N = 152) vihet në grafik kundrejt stoikiometrisë së tyre, vlerave S dhe efikasitetit FRET (paneli i sipërm, shiriti i ngjyrave pasqyron ndodhjen).Mund të dallohen tre lloje agregate: agregate vetëm -αS me S~1 dhe FRET~0, agregate vetëm me Tau me S~0 dhe FRET~1 dhe agregate heterogjene Tau/αS me S të ndërmjetëm dhe FRET Vlerësimet e sasisë. e të dy proteinave shënjuese të zbuluara në çdo agregat heterogjen (N = 100) tregohen në panelin e poshtëm (shkalla e ngjyrave pasqyron shfaqjen).Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.
Maturimi ose plakja e kondensatave të proteinave të lëngshme në struktura të ngjashme me xhel ose të ngurta me kalimin e kohës është raportuar të jetë përfshirë në disa funksione fiziologjike të kondensatës47 si dhe në sëmundje, si një proces jonormal që i paraprin grumbullimit të amiloidit 7, 48, 49. Këtu ne studiojmë në detaje ndarjen e fazave dhe sjelljen.LSPT αS në prani të polikacioneve të rastësishme në një mjedis të kontrolluar me përqendrime të ulëta mikromolare dhe kushte fiziologjikisht të rëndësishme (vini re se përqendrimi fiziologjik i llogaritur i αS është >1 µM50), duke ndjekur sjelljen tipike të LPS të drejtuar nga termodinamikisht.Ne zbuluam se αS, i cili përmban një rajon C-terminal të ngarkuar shumë negativisht në pH fiziologjik, është në gjendje të formojë pika të pasura me proteina në tretësirën ujore nëpërmjet LLPS në prani të peptideve të çrregullta shumë kationike si pLK ose Tau përmes procesit elektrostatik. kondensimi kompleks në prani të makromolekulave të grumbullimit.Ky proces mund të ketë efekte përkatëse në mjedisin qelizor ku αS ndeshet me molekula të ndryshme polikationike të lidhura me grumbullimin e tij të lidhur me sëmundjen si in vitro ashtu edhe in vivo51,52,53,54.
Në shumë studime, dinamika e proteinave brenda pikave është konsideruar si një nga faktorët kryesorë që përcaktojnë procesin e maturimit55,56.Në koacervatet elektrostatike αS me polikacionet, procesi i maturimit me sa duket varet nga forca e ndërveprimeve me polikacionet, valenca dhe shumësia e këtyre ndërveprimeve.Teoria e ekuilibrit sugjeron që një peizazh ekuilibri i dy gjendjeve të lëngëta do të ishte prania e një pikëze të madhe të pasur me biopolimere që drejtojnë LLPS57,58.Rritja e pikave mund të arrihet me maturimin e Ostwald59, bashkimin60 ose konsumimin e monomerit të lirë në fazën e shpërndarë61.Për αS dhe Tau441, ΔNt-Tau ose pLK, shumica e proteinës u përqendrua në kondensat në kushtet e përdorura në këtë studim.Sidoqoftë, ndërsa pikat tau me madhësi të plotë u bashkuan me shpejtësi pas lagështimit të sipërfaqes, bashkimi dhe lagja e pikave ishin të vështira për ΔNt-Tau dhe pLK, duke sugjeruar një humbje të shpejtë të vetive të lëngshme në këto dy sisteme.Sipas analizës sonë FLIM-FRET, pikat e vjetra pLK dhe ΔNt-Tau treguan një shkallë të ngjashme të grumbullimit të proteinave (jetë e ngjashme fluoreshence) si pikat origjinale, duke sugjeruar që rrjeti i proteinave origjinale u mbajt, megjithëse më i ngurtë.
Ne i racionalizojmë rezultatet tona eksperimentale në modelin e mëposhtëm (Figura 8).Pikat e formuara fillimisht përkohësisht janë shpesh rrjete proteinash pa kompensim elektrostatik, dhe për këtë arsye ka zona të çekuilibrit të ngarkesës, veçanërisht në ndërfaqen e pikave, duke rezultuar në pika me një potencial të lartë elektrostatik sipërfaqësor.Për të kompensuar ngarkesën (një fenomen zakonisht i referuar si zbrazje e valencës) dhe për të minimizuar potencialin sipërfaqësor të pikave, pikat mund të përfshijnë polipeptide të reja nga faza e holluar, të riorganizojnë rrjetet e proteinave për të optimizuar ndërveprimet ngarkesë-ngarkesa dhe të ndërveprojnë me pikat e tjera.me sipërfaqe (të lagura).Pikat αS/pLK, për shkak të rrjetit të tyre më të thjeshtë proteinik (vetëm ndërveprimet heterotipike ndërmjet αS dhe pLK) dhe afinitetit më të madh për ndërveprimet protein-proteinë, duket se janë në gjendje të balancojnë ngarkesën e kondensatës më shpejt;në të vërtetë, ne vëzhguam kinetikë më të shpejtë të proteinave në coacervates αS/pLK të formuara fillimisht sesa në αS/Tau.Pas zbrazjes së valencës, ndërveprimet bëhen më pak kalimtare dhe pikat humbasin vetitë e tyre të lëngshme dhe kthehen në pika të ngjashme me xhel, jo të ndezshme me një potencial të ulët sipërfaqësor elektrostatik (dhe për këtë arsye të paaftë për të lagur sipërfaqen).Në të kundërt, pikat αS/Tau janë më pak efikase në optimizimin e ekuilibrit të ngarkesës së pikave për shkak të rrjeteve më komplekse të proteinave (me ndërveprime homotipike dhe heterotipike) dhe natyrës më të dobët të ndërveprimeve të proteinave.Kjo rezulton në pika që ruajnë sjelljen e lëngut për periudha të gjata kohore dhe shfaqin një potencial të lartë elektrostatik sipërfaqësor që tenton të minimizohet duke u bashkuar dhe rritur (duke minimizuar raportin sipërfaqe/vëllim të pikave) dhe duke lagur sipërfaqen kimike hidrofile.Kjo krijon biblioteka të mëdha proteinash të përqendruara që ruajnë vetitë e lëngjeve pasi ndërveprimet mbeten shumë kalimtare për shkak të kërkimit të vazhdueshëm për optimizimin e ngarkesës në rrjetin e proteinave.Interesante, format e cunguara në fund të Taut, duke përfshirë disa izoforma natyrale62, shfaqin sjellje të ndërmjetme, me disa coacervates që plaken me αS në pika të ngjashme me xhel me jetëgjatësi, ndërsa të tjera shndërrohen në kondensata të mëdha të lëngshme.Ky dualitet në maturimin e koacervateve elektrostatike αS është në përputhje me studimet e fundit teorike dhe eksperimentale të LLPS që kanë identifikuar një korrelacion midis varfërimit të valencës dhe sitës elektrostatike në kondensata si një çelës për kontrollin e madhësisë së kondensatës dhe vetive të lëngut.Mekanizmi 58.61.
Kjo skemë tregon rrugën e supozuar të grumbullimit të amiloidit për αS dhe Tau441 nëpërmjet LLPS dhe LSPT.Me rajone shtesë të pasura me anion (e kuqe) dhe të pasura me katione (blu), koacervatet elektrostatike αS dhe tau me valencë të kënaqshme kanë energji sipërfaqësore më të ulët dhe për rrjedhojë më pak bashkim, duke rezultuar në plakjen e shpejtë të pikave.Arrihet një gjendje e qëndrueshme xheli jo e grumbulluar..Kjo situatë është shumë e favorshme në rastin e sistemit αS/pLK për shkak të afinitetit më të lartë dhe rrjetit më të thjeshtë të ndërveprimit të çifteve proteinike, i cili lejon një tranzicion të shpejtë si xhel.Përkundrazi, pikat me valencë të pakënaqshme dhe, për rrjedhojë, rajone të ngarkuara me proteina të disponueshme për ndërveprim, e bëjnë më të lehtë për koacervatin të shkrihet dhe të laget sipërfaqja hidrofile në mënyrë që të reduktojë energjinë e lartë sipërfaqësore të saj.Kjo situatë është e preferueshme për coacervates αS/Tau441, të cilat kanë një rrjet kompleks shumëvalent të përbërë nga ndërveprime të dobëta Tau-Tau dhe αS-Tau.Nga ana tjetër, koacervatet më të mëdha do të ruajnë më lehtë vetitë e tyre të ngjashme me lëngun, duke lejuar që të ndodhin ndërveprime të tjera proteinë-proteinë.Përfundimisht, agregatet heterogjene amiloide që përmbajnë αS dhe tau formohen brenda lëngut koacervat, të cilat mund të lidhen me ato që gjenden në trupat e përfshirjes, të cilat janë shenja dalluese të sëmundjeve neurodegjenerative.
Strukturat e mëdha të ngjashme me lëngun e formuar gjatë maturimit të αS/Tau441 me një mjedis proteinik shumë të ngjeshur, por dinamik dhe, në një masë më të vogël, koacervatet αS/ΔNt-Tau janë rezervuarë idealë për bërthamimin e grumbullimit të proteinave.Ne kemi vëzhguar me të vërtetë formimin e agregateve të proteinave të ngurta në këtë lloj koacervatesh proteinash, që shpesh përmbajnë αS dhe tau.Ne kemi treguar se këto heteroagregate stabilizohen nga ndërveprimet jo-elektrostatike, janë në gjendje të lidhin ngjyrat ThT specifike të amiloidit në të njëjtën mënyrë si fibrilet tipike amiloide dhe në të vërtetë kanë rezistencë të ngjashme ndaj ndikimeve të ndryshme.Agregatet αS/tau të formuara nga LLPS u treguan se kishin veti të ngjashme me amiloidin.Në të vërtetë, varianti i pjekur i Tau me mangësi në grumbullimin e amiloidit është i dëmtuar ndjeshëm në formimin e këtyre agregateve heterogjene αS brenda koacervatit elektrostatik të lëngët.Formimi i agregateve αS/Tau441 u vu re vetëm brenda koacervateve, të cilat ruanin veti të ngjashme me lëngun, dhe asnjëherë, nëse koacervatet/pikat nuk arrinin gjendjen e xhelit.Në rastin e fundit, forca e shtuar e ndërveprimeve elektrostatike dhe, si rezultat, ngurtësia e rrjetit të proteinave parandalojnë rirregullimet e nevojshme konformative të proteinave për të krijuar ndërveprime të reja proteinike të nevojshme për bërthamimin e amiloidit.Megjithatë, kjo mund të arrihet në coacervate më fleksibël, të ngjashme me lëngjet, të cilat nga ana e tyre kanë më shumë gjasa të mbeten të lëngshme ndërsa rriten në madhësi.
Fakti që formimi i agregateve brenda fazës së kondensuar është i preferueshëm në kondensatat e mëdha αS/Tau sesa në pikat e vogla që xhelin shpejt, nxjerr në pah rëndësinë e identifikimit të faktorëve që kontrollojnë bashkimin e pikave.Kështu, jo vetëm që ka një tendencë për ndarje fazore, por madhësia e kondensatës duhet të kontrollohet për funksionimin e duhur si dhe parandalimin e sëmundjeve58,61.Rezultatet tona theksojnë gjithashtu rëndësinë e ekuilibrit midis LLPS dhe LSPT për sistemin αS/Tau.Ndërsa formimi i pikave mund të mbrojë kundër grumbullimit të amiloidit duke reduktuar sasinë e monomereve të proteinave të disponueshme në kushte ngopjeje, siç është propozuar në sisteme të tjera63,64, shkrirja e pikave në nivele të larta të pikave mund të çojë në grumbullimin e brendshëm të proteinave nëpërmjet rirregullimeve të ngadalta konformative.rrjetet e proteinave..
Në përgjithësi, të dhënat tona theksojnë fuqimisht rëndësinë e valencës kohezive dhe ndërveprimeve të kënaqur/pakënaqur në rrjetet e rënies në kontekstin e LSPT.Në veçanti, ne tregojmë se kondensatat me gjatësi të plotë αS/Tau441 janë në gjendje të shkrihen dhe bërthamohen në mënyrë efikase për të formuar heteroagregate të ngjashme me amiloidin që përfshijnë të dyja proteinat dhe propozojnë një mekanizëm molekular bazuar në rezultatet tona eksperimentale.Bashkë-agregimi i dy proteinave në koacervatin e lëngut αS/Tau që ne raportojmë këtu mund të lidhet vërtet me bashkëlokalizimin e dy proteinave në përfshirje, të cilat janë shenja dalluese të sëmundjes dhe mund të kontribuojnë në kuptimin e marrëdhënies midis LLPS dhe LLPS dhe grumbullimi i amiloidit, duke i hapur rrugën PZHB-së shumë të ngarkuar në neurodegjenerim.
Variantet monomerike WT-αS, mutantët e cisteinës (Q24C-αS, N122C-αS) dhe ΔCt-αS (Δ101-140) u shprehën në E. coli dhe u pastruan siç përshkruhet më parë.5 mM DTT u përfshi në të gjitha hapat në pastrimin e mutantëve të cisteinës αS për të parandaluar formimin e lidhjes disulfide.Izoforma Tau441 (plazmidi i marrë nga Addgene #16316), varianti ΔNt-Tau (Δ1–150, i marrë nga klonimi IVA me abetare CTTTAAGAAGGAGAGATACATATGATCGCCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC-27TCau3-AggantpurdD1-15-Aggantpurd. primer) kulturat E. coli ishin rritur në OD600 = 0.6-0.7 në 37°C dhe 180 rpm, dhe shprehja u nxit me IPTG për 3 orë në 37°C.Mblidhni qelizat në 11,500 xg për 15 minuta në 4 °C dhe lani me tampon fiziologjik që përmban 150 mM NaCl.Risuspendoni peletin në tampon lize (20 ml për 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidinë 50 μptin μM, cope).Hapi i sonikacionit u krye në akull me një amplitudë prej 80% për 10 pulse (1 min ndezur, 1 min jashtë).Mos i kaloni 60 ml në një ultratingull.Lizat e E. coli u ngrohën në 95° C për 20 minuta, më pas u ftohën në akull dhe u centrifuguan në 127,000 × g për 40 minuta.Supernatanti i sqaruar u aplikua në një membranë 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) dhe u dializua kundër 4 L tampon dializë (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT , PMSF 0,1 mM) për 10 orë.Një kolonë këmbimi kationesh prej 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) u ekuilibrua me tampon ekuilibri (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Taulysati u filtua përmes një filtri PVDF 0.22 μm dhe u injektua në kolonë me një shpejtësi rrjedhjeje prej 1 ml/min.Elucioni u krye gradualisht, tau u elua me tampon elucioni 15-30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Fraksionet u analizuan me SDS-PAGE dhe çdo fraksion që përmban një brez me peshën e pritur molekulare të tau u përqendrua duke përdorur një filtër centrifuge 10 kDa dhe u zëvendësua me një tampon që përmban 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM dhe DTT 2 mM për përqendrimi përfundimtar i proteinës ishte 100 μM.Zgjidhja e proteinës u kalua më pas përmes një filtri PVDF 0.22 μm, u ngri shpejt dhe u ruajt në -80°C.Proteina K18 u ofrua me dashamirësi nga Prof. Alberto Boffi.Pastërtia e preparatit ishte >95% siç konfirmohet nga SDS-PAGE dhe MALDI-TOF/TOF.Cisteina të ndryshme u etiketuan kimikisht me AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ose TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).u konfirmuan nga absorbimi dhe MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau dhe K18 u etiketuan me mbetje cisteine ​​vendase në pozicionet 191 dhe 322 duke përdorur Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Gjermani) duke ndjekur të njëjtën procedurë.Hartat e tarifës neto për mbetje për αS dhe Tau441 u krijuan duke përdorur CIDER66.
Poli-L-lizina e ngurtë (pLK DP 90-110 sipas NMR nga furnizuesi, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, SHBA) u tret në 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 deri në 10 mM përqendrim, procesi sonikohet për 5 minuta në një banjë uji me ultratinguj dhe ruajeni në -20°C.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, SHBA) dhe FITC-dekstran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, SHBA) janë të tretshëm në ujë dhe të shpërndarë gjerësisht në tampon LLPS.Dializa largon kripërat kontaminuese.Më pas ato u filtruan përmes një filtri shiringe me madhësi pore prej 0,22 μm dhe përqendrimet e tyre u llogaritën duke përdorur një refraktometër (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, SHBA).Mostrat LLPS u përgatitën në temperaturën e dhomës në rendin e mëposhtëm: buferi dhe nxjerrja u përzien dhe 1 mM tris(2-karboksietil)fosfinë (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etan- 1, 2-diildinitril) acid tetraacetik (EDTA, karboksinth) dhe një përzierje e frenuesit të proteazës 1% (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Më pas shtohen αS dhe polikacionet e shkrira (opsionet pLK ose Tau).Për eksperimentet e serive kohore të tioflavinës-T (ThT, Carbosynth, Compton, MB), përdorni përqendrimin total të ThT që të jetë gjysma e përqendrimit αS.Përziejini butësisht, por tërësisht mostrat për t'u siguruar që ato janë homogjene.Përqendrimi i secilit komponent ndryshonte nga eksperimenti në eksperiment, siç përshkruhet në seksionin Rezultatet.Azidi u përdor në një përqendrim prej 0.02% (w/v) sa herë që kohëzgjatja e eksperimentit i kalonte 4 orë.Për të gjitha analizat që përdorin mostrat LLPS, lëreni përzierjen të ekuilibrohet për 5 minuta përpara analizës.Për analizën e shpërndarjes së dritës, 150 µl mostra u ngarkuan në mikropllaka jo-detyruese 96 pusesh (µClear®, e zezë, F-Bottom/Pusi i oxhakut, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austri) dhe u mbuluan me film ngjitës.LLP-të u monitoruan duke matur përthithjen në 350 nm në qendër të tretësirës në një lexues pllakash CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Gjermani).Eksperimentet u kryen në tre kopje në 25°C dhe gabimet u llogaritën si devijimi standard nga mesatarja.Faza e holluar u mat me centrifugimin e mostrës dhe analizën e xhelit SDS-PAGE, dhe fraksioni αS në fazat e holluara dhe të koncentruara u përcaktua në sasi në zgjidhje të ndryshme LLPS.Një mostër 100 μl LLPS që përmban 1 μM αS të etiketuar me AF488 u përgatit nga përzierja e plotë e ndjekur nga centrifugimi në 9600 × g për 30 minuta, pas së cilës precipitati ishte zakonisht i dukshëm.50 μl e sipërme e supernatantit u përdor për kuantifikimin e proteinave duke përdorur xhel SDS-PAGE.Xhelet u skanuan me filtra AF488 duke përdorur një sistem imazherie me xhel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ose u ngjyrosën me njollë Coomassie dhe u vizualizuan me filtra të përshtatshëm.Bandat që rezultuan u analizuan duke përdorur versionin ImageJ 1.53i (Institutet Kombëtare të Shëndetit, SHBA).Eksperimentet u kryen në dy kopje në dy eksperimente të ndryshme me rezultate të ngjashme.
Në mënyrë tipike, 150 μl mostra u aplikuan në mikropllaka jo-detyruese me 96 pusi dhe u vizualizuan në temperaturën e dhomës në një mikroskop të përmbysur Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Gjermani).Për eksperimentet në vend, u përdorën gjithashtu pllaka μ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Gjermani) ose mikropllaka polistireni 96 pusesh (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Si burime ndriçimi u përdorën llambat halogjene EL6000 ose halogjene metalike të merkurit (përkatësisht për imazhe BF/DIC dhe WF).Për mikroskopin WF, një objektiv ajri me zmadhim 40x (Leica Microsystems, Gjermani) u përdor për të fokusuar dritën në kampion dhe për ta mbledhur atë.Për mostrat e etiketuara AF488 dhe ThT, ngacmimi dhe emetimi i filtrit me grupe standarde të filtrave GFP, filtra brezkalimi ngacmimi dhe emetimi, përkatësisht, filtra brezkalimi 460–500 nm dhe 512–542 nm dhe një pasqyrë dykroike 495 nm.Për mostrat e etiketuara me Atto647N, u përdor një grup standard filtrash Cy5 me filtra brezkalimi ngacmimi dhe emetimi 628–40 nm dhe 692–40 nm, respektivisht, dhe një pasqyrë dykroike 660 nm.Për mikroskopin BF dhe DIC, përdorni të njëjtin objektiv të mbledhjes së dritës së reflektuar.Drita e mbledhur u regjistrua në një kamerë Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Gjermani).Koha e ekspozimit ishte 50 ms për imazhe me mikroskop BF dhe DIC dhe 20-100 ms për imazhe me mikroskop WF.Për krahasim, koha e ekspozimit për të gjitha eksperimentet me ThT ishte 100 ms.Eksperimentet me kalim kohe u kryen për të vizualizuar bashkimin e pikave, me imazhe që mblidheshin çdo 100 ms për disa minuta.ImageJ (NIH, USA) është përdorur për analizën e imazhit.Eksperimentet u kryen në tre kopje me rezultate të ngjashme.
Për eksperimentet e kolokalizimit, FRAP dhe rindërtimin 3D, imazhet u morën në një mikroskop konfokal të përmbysur Zeiss LSM 880 duke përdorur një botim blu ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Gjermani).Mostrat prej 50 µl u aplikuan në enët µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Gjermani), të trajtuara me një polimer hidrofilik (ibiTreat) dhe të montuara në një objektiv zhytjeje vaji 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) në DIC).Imazhet janë marrë duke përdorur linja lazer argon 458 nm, 488 nm dhe 633 nm me një rezolucion prej 0,26 μm/pixel dhe një kohë ekspozimi prej 8 μs/pixel për dritaret e ngacmimit dhe zbulimit të emetimeve prej 470-600 nm, 493-628 nm, 493-628 nm. dhe 638-755 nm u përdor për të vizualizuar përkatësisht ThT, AF488 dhe Atto647N.Për eksperimentet FRAP, fotografia me kalim kohe të çdo kampioni u regjistrua me 1 kornizë për sekondë.Eksperimentet u kryen në tre kopje në temperaturën e dhomës me rezultate të ngjashme.Të gjitha imazhet u analizuan duke përdorur softuerin e edicionit blu Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Gjermani).Lakoret FRAP u normalizuan, u grafikuan dhe u përshtatën me të dhënat e intensitetit/kohës të nxjerra nga imazhet duke përdorur Zen 2 duke përdorur OriginPro 9.1.Lakoret e rikuperimit u përshtatën në një model mono-eksponencial për të llogaritur difuzionin molekular me një term shtesë eksponencial për të llogaritur efektin zbardhues të përvetësimit.Më pas ne llogaritëm D duke përdorur rrezen nominale të zbardhjes dhe gjysmën e jetës së rikuperimit të përcaktuar më parë si në ekuacionin e Kang et al.5 35 treguar.
Variantet e vetme të cisteinës të αS u sintetizuan me 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) në pozicionet 24 (TEMPOL-24-αS) dhe 122 (TEMPOL-122-αS), përkatësisht.Etiketimi i rrotullimit Për eksperimentet EPR, përqendrimi αS u vendos në 100 μM dhe përqendrimi i PEG ishte 15% (w/v).Për kushte të ndryshme grumbullimi, raporti αS:pLK ishte 1:10, ndërsa raportet αS:ΔNt-Tau dhe αS:Tau441 mbaheshin në 1:1.Për eksperimentet e titrimit të lidhjes në mungesë të grumbullimit, TEMPOL-122-αS u mbajt në 50 μM dhe polikacionet u titruan në përqendrime në rritje, duke përgatitur secilën gjendje veç e veç.Matjet CW-EPR u kryen duke përdorur një spektrometër me brez X Bruker ELEXSYS E580 të pajisur me një rezonator Bruker ER4118 SPT-N1 që funksionon në një frekuencë të mikrovalës (SHF) prej ~ 9,7 GHz.Temperatura u vendos në 25°C dhe kontrollohej nga një kriostat me azot të lëngshëm.Spektrat janë marrë në kushte të pangopura me një fuqi MW prej 4 mW, një amplitudë modulimi prej 0.1 mT dhe një frekuencë modulimi prej 100 kHz.Intensitetet spektrale u normalizuan për të shmangur ndryshimet në përqendrimet e rrotullimit midis mostrave dhe reduktimin e mundshëm të rrotullimit për shkak të përqendrimeve të mbetura të agjentëve reduktues në mostrat që përmbajnë Tau441 ose ΔNt-Tau (të pranishme në tretësirat origjinale të proteinave).Vlerat e dhëna të g janë marrë si rezultat i modelimit spektral EPR të kryer duke përdorur softuerin Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) të implementuar në Matlab®67.Për modelimin e të dhënave janë përdorur modele izotropike një/dy komponentësh.Pas normalizimit të të gjitha sinjaleve, mbetjet u llogaritën duke zbritur çdo simulim nga spektri eksperimental përkatës.Për analizën e titrimit të lidhjes, intensiteti relativ i brezit të tretë me brezin e dytë të spektrit të normalizuar EPR (IIII/III) u përdor për të monitoruar lidhjen e polikacioneve me αS.Për të vlerësuar konstantën e disociimit (Kd), kurba rezultuese iu përshtat një modeli të përafërt që supozon n vende lidhëse identike dhe të pavarura.
Eksperimentet e spektroskopisë NMR u kryen duke përdorur një spektrometër NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) të pajisur me një kriosondë dhe gradient Z.Të gjitha eksperimentet u kryen duke përdorur 130-207 μM αS dhe ekuivalentët përkatës αS/ΔNt-Tau dhe pLK në 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 dhe u kryen në 15°C.Për të monitoruar LPS nga NMR, 10% PEG iu shtua mostrave të para-përziera.Grafiku i perturbimit të zhvendosjes kimike (Fig. 1b) tregon zhvendosjet kimike mesatare 1H dhe 15N.Spektrat αS 2D1H-15N HSQC u caktuan bazuar në një caktim të mëparshëm (hyrja BMRB #25227) dhe u konfirmuan duke regjistruar dhe analizuar spektrat 3D të HNCA, HNCO dhe CBCAcoNH.Zhvendosjet kimike 13Cα dhe 13Cβ u llogaritën në prani të ΔNt-Tau ose pLK për të matur ndryshimet e mundshme në tendencat e strukturës dytësore në krahasim me zhvendosjet kimike αS në konformacionin e pastër të rastit të spirales 68 (Figura plotësuese 5c).Normat R1ρ u matën duke regjistruar eksperimente hsqctretf3gpsi (të marra nga biblioteka e Bruker) me vonesa prej 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 dhe 800 ms, dhe funksionet eksponenciale u rregulluan në kulmin e vonesës në shkallë të ndryshme. herë për të përcaktuar R1ρ dhe pasigurinë e tij eksperimentale.
Eksperimentet e mikroskopisë së fluoreshencës me zgjidhje me dy ngjyra u kryen në një mikroskop konfokal fluoreshent MT200 me zgjidhje me kohë (PicoQuant, Berlin, Gjermani) me një pajisje për numërimin e fotoneve të vetme të korreluara me kohë (TCSPC).Koka e diodës lazer përdoret për ngacmim pulsues të ndërthurur (PIE), rrezja kalon përmes një valëdhënëse me një modalitet të vetëm dhe akordohet në një fuqi lazer prej 10 deri në 100 nW për linjat lazer 481 nm dhe 637 nm të matura pas një pasqyre dykroike.Kjo siguron një shpejtësi optimale të numërimit të fotoneve, duke shmangur efektet e aliasing fotoneve, fotozbardhjes dhe ngopjes.Mbulesat ose pllakat e angiogjenezës μ-rrëshqitës (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Gjermani) u vendosën drejtpërdrejt në ujë zhytjeje mbi një lente Super Apochromat 60x NA 1.2 me një jakë korrigjuese (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Një pasqyrë dykroike 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, SHBA) u përdor si ndarës i rrezes kryesore.Rrezatimi i pafokusuar bllokohet nga një vrimë me diametër 50 mikron, më pas rrezatimi i fokusuar ndahet në 2 shtigje zbulimi nga një ndarës rreze 50/50.Para detektorit u përdorën filtra të emetimit të brezit (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 për ngjyrën jeshile (AF488) dhe 690/70 për ngjyrën e kuqe (Atto647N).Si detektorë u përdorën diodat e ortekëve me një foton (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itali).Mbledhja dhe analiza e të dhënave u kryen duke përdorur softuerin SymphoTime64 të disponueshëm në treg (PicoQuant GmbH, Berlin, Gjermani).
Pesëdhjetë mikrolitra mostra LLPS u aplikuan në puset e angiogjenezës μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Gjermani).Imazhet që rezultojnë fokusohen në 20 µm mbi fundin e pusit për distancën optimale të punës objektive për pikat e varura dhe në ~1 µm për gomat dhe pikat me një rezolucion boshtor prej të paktën 0,25 µm/pixel dhe një kohë vonese prej 400 µs/pixel.Zgjidhni të dhënat duke aplikuar një prag intensiteti bazuar në intensitetin mesatar të sinjalit të sfondit (PBG, mesatare + 2σ) për çdo kanal, në mënyrë që të zgjidhen vetëm pikat, gomat ose pikat e proteinave të lëngshme, duke filtruar çdo origjinë të mundshme nga faza e shpërndarë.Për të analizuar jetëgjatësinë e çdo specie (τ) të çdo kanali (jeshile, "g" për AF488 dhe e kuqe, "r" për Atto647N), ne zgjodhëm rajonet me interes (ROI) që përmbajnë pika, gomone ose njolla (Figura plotësuese 1 ).8b) dhe i nxori ato duke përshtatur prishjen e tyre gjatë gjithë jetës (τD, τR dhe τP për pikat, gomat ose pikat, respektivisht, shih Fig. Suplementare 8c) në çdo kanal duke përdorur një analizë të përshtatjes së bishtit dhe një model prishjeje me dy komponentë.Mesatarja τ nga τ .ROI që prodhonin shumë pak fotone për një përshtatje shumë-eksponenciale u përjashtuan nga analiza.Prerja e përdorur ishte <104 fotone për gomone dhe pika dhe 103 për pika.Pikat kanë një prag më të ulët sepse është e vështirë të përftohen kthesa të kalbjes me vlera më të larta intensiteti, pasi pikat në fushën e imazhit janë zakonisht më të vogla dhe më pak të shumta.ROI me numërimin e fotoneve mbi kufirin e akumulimit të fotoneve (të vendosur në >500 numërime/piksel) u hodhën gjithashtu për analizë.Përputhni kurbën e prishjes së intensitetit të marrë nga rajoni i interesit me një intensitet në 90% të maksimumit (pak pas intensitetit maksimal të prishjes) që nga fillimi i jetës së shërbimit për të siguruar ndërhyrje minimale IRF duke ruajtur të njëjtën për prishjen e të gjithë intensitetit parametrat Dritarja kohore relative U analizuan 25 deri në 50 ROI për gomone dhe pika dhe 15-25 ROI për pika, imazhe të zgjedhura nga më shumë se 4 përsëritje të regjistruara nga të paktën 3 eksperimente të pavarura.T-testet me dy bishta janë përdorur për të vlerësuar diferencat statistikore midis specieve ose midis sistemeve të përbashkëta.Për një analizë pixel-nga-pixel të jetëgjatësisë (τ), u llogarit zbutja totale e jetëgjatësisë në fushë për çdo kanal dhe u krye një përafrim i një modeli zbutjeje eksponenciale 2/3-komponent.Zbutja e jetëgjatësisë për çdo piksel u përshtat më pas duke përdorur vlerat τ të llogaritura më parë, duke rezultuar në një imazh të përshtatjes pseudongjyrësh FLIM.Gama e jetëgjatësisë së përshtatjes së bishtit ishte e njëjtë në të gjitha imazhet e të njëjtit kanal dhe çdo prishje prodhonte mjaft fotone për të siguruar një përshtatje të besueshme.Për analizën FRET, pikselët u zgjodhën duke aplikuar një prag më të ulët të intensitetit prej 100 fotonesh, i cili mesatarisht përcaktoi një sinjal sfondi (FBG) prej 11 fotonesh.Intensiteti i fluoreshencës i secilit kanal u korrigjua nga faktorët e korrigjimit të përcaktuar eksperimentalisht: 69 ndërthurja spektrale α ishte 0,004, ngacmimi i drejtpërdrejtë β ishte 0,0305, efikasiteti i zbulimit γ ishte 0,517.Efikasiteti FRET në nivelin e pikselit llogaritet më pas duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm:
ku FDD është intensiteti i fluoreshencës i vërejtur në kanalin e dhuruesit (jeshile), FDA është intensiteti i fluoreshencës i vërejtur në kanalin pranues (i kuq) nën ngacmim indirekt, dhe FAA është intensiteti i fluoreshencës i vërejtur në kanalin pranues (i kuq) nën ngacmim direkt ( PIE).Në kanal vërehen impulse me intensitet fluoreshence).
Vendosni 100 µl solucionesh të reaksionit LLPS që përmbajnë 25 µM monomerik të paetiketuar Tau441 (me ose pa 25 µM αS) në tampon LLPS (të plotësuar si më sipër) në mikropllakat 96 pusesh jo-lidhëse me shtresë petë ngjitëse dhe formimi i pikave u kontrollua me mikroskopin WF ekuilibër.brenda 10 min.Pas 48 orësh inkubimi në temperaturën e dhomës, u konfirmua prania e gomave dhe njollave proteinike.Më pas hiqeni me kujdes lëngun mbi gomone nga puset, më pas shtoni 50 L tampon disociimi (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) dhe inkuboni për 10 min.Përqendrimi i lartë i kripës siguron që LLPS të mos përsëritet për shkak të PEG-së së mbetur dhe asambletë e mundshme të proteinave të formuara vetëm nga ndërveprimet elektrostatike do të çmontohen.Pjesa e poshtme e pusit u gërvisht me kujdes me një majë mikropipete dhe zgjidhja që rezulton u transferua në një pus vëzhgimi bosh.Pas inkubimit të mostrave me 50 μM ThT për 1 orë, prania e njollave të izoluara u kontrollua me mikroskop WF.Përgatitni fibrilet αS të sonikuara duke inkubuar 300 µl të një solucioni αS 70-µM në PBS me pH 7,4, azid natriumi 0,01% në 37 °C dhe 200 rpm në një tundës orbital për 7 ditë.Zgjidhja më pas u centrifugua në 9600 × g për 30 min, peleti u risuspendua në PBS pH 7.4 dhe u sonikua (1 min, cikli 50%, amplitudë 80% në një sonikator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) mostra fibrile me një shpërndarje relativisht uniforme të përmasave të fibrileve të vogla.
Analiza FCS/FCCS dhe zbulimi i koincidencës me dy ngjyra (TCCD) u kryen në të njëjtin mikroskop konfokal fluoreshent me zgjidhje kohore MT200 (Pico-Quant, Berlin, Gjermani) i përdorur për eksperimentet e mikroskopisë FLIM-FRET duke përdorur modalitetin PIE.Fuqia e lazerit për këto eksperimente u shtua në 6,0 µW (481 nm) dhe 6,2 µW (637 nm).Kombinimi i këtyre fuqive lazer u zgjodh për të prodhuar shkëlqim të ngjashëm për çiftet e fluoroforeve të përdorura duke arritur shpejtësinë optimale të numërimit dhe shmangien e fotozbardhjes dhe ngopjes.Mbledhja dhe analiza e të dhënave u kryen duke përdorur softuerin e disponueshëm në treg SymphoTime64 versioni 2.3 (PicoQuant, Berlin, Gjermani).
Mostrat e agregateve të izoluar αS/Tau të marra duke përdorur LLPS hollohen në tampon izolues në përqendrimin e duhur monomolekular (zakonisht një hollim 1:500, pasi agregatët janë tashmë në përqendrime të ulëta kur izolohen nga mostrat e bashkuara).Mostrat u aplikuan direkt në mbulesa (Corning, SHBA) të paralyera me një zgjidhje BSA në një përqendrim prej 1 mg/mL.
Për analizën PIE-smFRET në kanalet jeshile dhe të kuqe, u aplikua një prag intensiteti më i ulët prej 25 fotonesh për të filtruar sinjalet me intensitet të ulët të shkaktuar nga ngjarjet monomerike (vini re se monomerët tejkalojnë mostrat e grumbulluara në krahasim me agregatët e izoluar).Ky prag u llogarit si pesëfishi i intensitetit mesatar të αS monomerik i marrë nga analiza e mostrave të monomerit të pastër në mënyrë që të përzgjidhen në mënyrë specifike agregatet për analizë.Qarku i makinës PIE, së bashku me marrjen e të dhënave TSCPC, ka mundësuar aplikimin e një filtri peshimi gjatë gjithë jetës që ndihmon në eliminimin e ndërlidhjes së sfondit dhe spektrit.Intensiteti i ndezjes i zgjedhur duke përdorur pragjet e mësipërme u korrigjua duke përdorur sinjalin mesatar të sfondit të përcaktuar nga histogramet e shfaqjes kundrejt intensitetit/koshit të mostrave vetëm me tampon.Shpërthimet e shoqëruara me agregate të mëdhenj zakonisht zënë disa kosha të njëpasnjëshme në gjurmën kohore (të vendosur në 1 ms).Në këto raste, u zgjodh një kosh me forcë maksimale.Për analizën FRET dhe stoikiometrike, u përdor faktori gama i përcaktuar teorikisht γ (0.517).Ndërlidhja spektrale dhe kontributet e ngacmimit të drejtpërdrejtë janë të papërfillshme (të përcaktuara eksperimentalisht) në fuqinë lazer të ngacmimit të përdorur.Efikasiteti dhe stoikiometria e FRET në një shpërthim llogaritet si më poshtë.